優良生防枯草芽孢桿菌CY1固態發酵研制生物有機肥工藝參數優化

李彬濤，韋小敏，來航線，李玉龍，王旭東

(西北農林科技大學資源環境學院，陜西 楊凌 712100)

固態發酵具有能耗低、環境污染少等優點，能使微生物保持原始的自然生長狀態，有利于發酵代謝產物的積累[1]。伴隨著新型功能菌株的篩選鑒定及作用機制的研究，枯草芽孢桿菌以其自身綠色環保且作用效果良好的獨特優勢被廣泛研究推廣[2]。枯草芽孢桿菌CY1(BacillussubtilisCY1)能夠通過分泌胞外酶等促進植物根系生長的物質，提高植物利用養分的能力，對番茄植株生長具有促進作用，同時可以通過提高植物體內防御酶活性增強植物對病原入侵的抵抗能力，兼具生物防治及促生效果[6]，可被用作固態發酵的接種劑制備功能型生物有機肥[3]。然而，目前生物有機肥的生產主要采用有益微生物與有機肥混合的方式進行，存在功能菌存活率低、產品質量不達標等問題，造成功能菌的浪費以及生產成本的增加[4]。2019年全國微生物肥料質量檢測結果顯示，約78%的微生物肥料因產品有效活菌數含量較低而不合格。菌種能否在基質中存活取決于其生長環境，與碳氮比、pH、含水量及生長因子密切相關[5]，然而目前此方面缺乏系統研究。因此，如何通過工藝參數優化實現功能益生菌的擴繁至關重要。

本研究通過固態發酵試驗，選取前期經過篩選鑒定得到的一株生防效果較好的枯草芽孢桿菌CY1為固態發酵功能菌劑[6]，結合原料成本及產品質量，以腐熟豬糞堆肥為發酵原料，麩皮、豆粕、玉米粉為發酵輔料，有效活菌數為觀測評價指標，采用Plackett-Burman設計、最陡爬坡法及響應面分析，優化固態發酵工藝條件，為固態發酵制備生物有機肥提供了基礎數據，對我國北方地區糧油副產物的綜合利用和資源開發具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菌株：生防枯草芽孢桿菌CY1，由西北農林科技大學資源環境學院資源環境微生物實驗室分離、鑒定、保藏。

發酵原料：腐熟豬糞基質，pH 8.21，含水量11.74%，有機質含量254.71 g·kg-1，總氮含量13.40 g·kg-1。

發酵輔料：麩皮、豆粕、玉米粉，購置于陜西省楊凌農業高新產業示范區農貿市場。其中，麩皮pH 9.30，含水量1.32%，有機質含量407.28 g·kg-1，總氮含量27.66 g·kg-1；豆粕pH 4.95，含水量1.95%，有機質含量448.80 g·kg-1，總氮含量81.21 g·kg-1；米粉pH 8.79，含水量2.12%，有機質含量404.26 g·kg-1，總氮含量55.37 g·kg-1。

種子培養基(LA液體培養基)：蛋白胨10 g·L-1，氯化鈉5 g·L-1，牛肉膏3 g·L-1，pH 7.2，121℃滅菌30 min。

固體活化培養基(LA固體培養基)：在LA液體培養基中加入15 g·L-1瓊脂粉。

1.2 試驗設計

1.2.1 單因素試驗 選取發酵輔料配比、原料輔料配比、接種量3個因素進行固態發酵試驗。輔料配比設置14∶1∶5、15∶1∶4、16∶1∶3、17∶1∶2、18∶1∶1共5個水平，原料輔料配比設置7∶3、8∶2、9∶1共3個水平，接種量設置1%、5%、10%、15%(mL·g-1)共4個水平，每個處理3個重復。調節初始含水量為30%，在37℃條件下培養7 d，分別取第3天及第7天樣測定CY1有效活菌數。

1.2.2 Plackett-Burman試驗 根據前期單因素試驗結果，采用PB試驗設計(A：初始pH；B：KH2PO4含量；C：MgSO4含量；D：空列項；E：MnSO4含量；F：發酵溫度；G：空列項；H：葡萄糖含量；I：(NH4)2SO4含量；J：空列項；K：含水量)，選取8個影響活菌數的主要因素，每個因素取高、低2個水平，其余3個因素為虛擬變量，用于誤差估計(表1)[7]。

表1 Plackett-Burman試驗因素水平表Table 1 Factors and levels of Plackett-Burman experiment design

1.2.3 最陡爬坡試驗 根據Plackett-Burman試驗及方差分析結果，篩選主要影響因素設計爬坡方向和步長，確定最陡上升路徑[8]。以活菌數為評價指標，確定最大響應區域，其余不顯著因素取中間值。

1.2.4 響應面(RSM)試驗 根據最陡爬坡試驗結果，采用Box-benhnken試驗設計，顯著因素的零水平取上述得到的中心點數值，高水平和低水平分別高于或低于零水平1個實際步長[9]。以初始pH、發酵溫度以及含水量為自變量，枯草芽孢桿菌活菌數量為響應值進行三因素三水平的響應面試驗，并對結果進行驗證。

1.3 研究方法

1.3.1 種子液的制備 將菌株CY1在固體活化培養基平板上于37℃培養箱中活化36 h，挑取單菌落接種于種子培養基，37℃、180 r·min-1培養20 h作為種子液，有效活菌數約為1.0×108CFU·mL-1。

1.3.2 活菌計數方法 稱取5 g發酵原料于含有45 mL無菌水的三角瓶中，加入適量小玻璃珠，30℃、180 r·min-1振蕩30 min，制得1∶10稀釋液。吸取1 mL稀釋液注入含有9 mL無菌水的離心管中，振蕩混勻，得到1∶100稀釋液。依次類推制成不同梯度10倍遞增稀釋液。采用涂布法進行接種，37℃恒溫培養箱中培養36 h后取出計有效活菌數(CFU·g-1，干重)[10-11]。

1.4 數據處理

每個處理重復3次，結果取其平均值表示。采用SPSS 20.0進行方差分析，采用Design Expert 9.0.2軟件進行Plackett-Burman試驗及響應曲面試驗設計和分析。

2 結果與分析

2.1 單因素條件下有效活菌數的變化特征

根據發酵輔料碳氮比，設置5個麩皮、豆粕、玉米粉配比水平進行單因素試驗(圖1A)。第3天時，各配比之間沒有顯著性差異。第7天時，隨著麩皮添加量的增大，有效活菌數先增加后下降，主要原因是麩皮具有更高的孔隙度，為微生物的生長繁殖提供充足的氧氣，當輔料配比達到15∶1∶4這個閾值時，碳源作為主要的影響因素，粒徑較小的玉米粉更有利于微生物的分解利用。因此，確定發酵輔料的配比為15∶1∶4。

以腐熟豬糞為發酵原料，麩皮、豆粕、玉米粉為發酵輔料，通過單因素試驗獲得最佳原料、輔料配比(圖1B)。第3天時，不同處理間存在顯著性差異，隨著原料添加量的增加，有效活菌數逐漸下降。第7天時，原料∶輔料為8∶2的條件下活菌數達到7.8×109CFU·g-1，顯著高于其他處理。因此，確定發酵原料輔料配比為8∶2。

接種量作為發酵的重要因素直接影響著發酵產物的有效活菌數(圖1C)。處理間在第3天和第7天均存在顯著性差異，有效活菌數隨著接種量的增加而增加。與第3天相比，第7天的有效活菌數在1%、5%、10%和15%的接種量下分別提高了10.88、12.10、11.42倍及9.05倍。然而，更大的接種量意味著更高昂的生產成本，因此，確定固態發酵初始接種量為5%。

注：小寫字母表示在同一時間下不同處理的差異顯著性(P<0.05)。Note: Lower case letters indicate the significant difference between treatments at the same time (P<0.05).圖1 固態發酵單因素試驗結果Fig.1 Single factor test results of solid fermentation

2.2 有效活菌數關鍵影響因素的確定

如表2、表3 Plackett-Burman試驗結果及方差分析所示， KH2PO4含量、MgSO4含量、MnSO4含量、發酵溫度、葡萄糖含量及含水量對有效活菌數的影響效應值為正；初始pH及(NH4)2SO4含量對有效活菌數的影響效應值為負。主效應P=0.0453(P<0.05)、R2為0.9621，表明該回歸模型顯著，PB試驗設計因素在所選取的水平范圍內對發酵產物有效活菌數的影響較顯著，其中，初始pH、發酵溫度、含水量可信度大于95%(P<0.05)，是影響有效活菌數的顯著因素。

表2 Plackett-Burman試驗結果Table 2 Results of Plackett-Burman experiment design

表3 Plackett-Burman試驗方差分析Table 3 Results of variance analysis of Plackett-Burman experiment

2.3 有效活菌數對關鍵影響因素的響應及模型的構建

根據Plackett-Burman試驗結果，對初始pH、發酵溫度、含水量3個顯著因素進行最陡爬坡試驗，其余因素取中間值(表4)。結果表明，初始pH為7.5、發酵溫度為36℃、含水量為26%時有效活菌數最大，達到3.91×1010CFU·g-1。

表4 最陡爬坡試驗設計與結果Table 4 Results of steepest ascent test

根據最陡爬坡試驗確定的中心點，以初始pH(A)、發酵溫度(B)、含水量(C)為自變量，活菌數(Y)為響應值，采用Box-benhnken中心組合設計試驗(表5)，通過方差分析統計檢驗確定最優組合(表6)。經過回歸擬合后，得到回歸方程：

表5 Box-benhnken試驗結果Table 5 Results of Box-benhnken experiment design

Y=4.66+0.0637A+0.1375B+0.2012C+0.1625AB-0.2500AC-0.3325BC-1.09A2-0.8885B2-0.5610C2

各因素對有效活菌數(Y)影響的順序為含水量>發酵溫度>初始pH。由表6可得，方程模型回歸擬合顯著(P<0.001)，失擬項不顯著(P>0.05)，其中，一次項C顯著、二次項A2、B2、C2極顯著、交互項BC顯著。該二次多項回歸方程決定系數R2為0.9681，表明自變量與因變量具有較強的線性關系，該方程較好地描述了各因素與響應值之間的真實關系，可用于確定固態發酵最佳工藝條件。

表6 Box-benhnken試驗方差分析Table 6 The results of variance analysis of Box-benhnken experiment

2.4 響應面分析

由圖2可得，有效活菌數隨著初始pH、發酵溫度及含水量的增大均呈現先增大后減少的趨勢，該響應曲面存在最優范圍。當固態發酵條件為初始pH 7.507、發酵溫度36.097℃、含水量26.325%時，有效活菌數檢出量最大，預測值為4.682×1010CFU·g-1。在初始pH 7.51、發酵溫度36.10℃、含水量26.33%的最佳發酵條件調整值下實際菌體數量為4.57×1010CFU·g-1，實測值與預測值接近。此外，響應值與預測值的相對誤差為2.45%，在可允許誤差5%的范圍之內，證實了該模型的有效性。因此，該響應模型對于固態發酵條件優化可行，此試驗方法具有較高的準確性，通過該方法，可獲得具有較高有效活菌數的固態發酵產物。

圖2 初始pH、發酵溫度、含水量交互影響有效活菌數的響應面Fig.2 Initial pH, fermentation temperature and water content interacted on the response surface of effective viable bacteria count

3 討 論

近年來隨著枯草芽孢桿菌功能的研究，其作為廣譜性的優良菌種得到越來越廣泛的應用[12]，常常被當作有益微生物添加劑制備生物有機肥[13-14]。孫一凡等[6]研究發現枯草芽孢桿菌CY1具有促進番茄生長、增強植株抗病性的能力，是一株良好的生防菌種。本研究在此基礎上，以該生防枯草芽孢桿菌CY1為接種菌劑，通過固態發酵工藝優化，旨在研制出一種具有生防作用的新型生物有機肥。

采用固態發酵的方法，在經過腐熟的有機物料中加入功能菌制備生物有機肥可有效減小土著雜菌對功能菌的影響[15]。碳氮比是影響固態發酵的一個關鍵因素，碳氮比過高時微生物由于氮不足生長會受到限制，碳氮比過低時發酵過程容易產生氨，過量的氨會抑制微生物的生長。本研究結果表明發酵原料、輔料質量比為8∶2，其中輔料麩皮、豆粕、玉米粉的質量比為15∶1∶4時有效活菌數含量最大。根據原料基礎理化性質，該條件下碳氮比約為19。大量研究對有機物料高溫堆肥的條件進行了探討，并得到了與之相似的結論，認為碳氮比為20～30[16]、pH為5.5～8.0[17]時有利于微生物菌劑促進有機物料的分解，提高堆肥腐熟度。因此，該營養條件有利于發酵功能菌的擴繁及生物有機肥有效活菌數的提高。接種量是影響固態發酵的另一個關鍵參數，接種量大可以有效提高菌體的繁殖速度，然而過大的接種量會造成菌種資源的浪費，接種量太小則會使發酵周期延長，增大污染風險。因此，探索并且掌握適宜的接種量是保證發酵效果的關鍵因素。本研究發現，固態發酵初始接種量為5%時菌種的擴繁效率最高，且發酵產物有效活菌數含量較高、成本較低。

本研究中PB試驗結果表明溫度、pH、含水量顯著影響固態發酵產品質量；主要是由于在微生物的生長過程中，蛋白質的合成酶、細胞的活性以及代謝產物的合成對溫度敏感[18]。此外，不同微生物本身的固有特性不同，生長發育對環境pH的要求也不同。本研究與前人的研究結果一致，即細菌在中性條件下生長較好[19]。黃小琴等[20]研究表明，麩皮、豆粕等比例混合為最佳發酵基質，添加5%蔗糖及5%酵母粉，在pH值7.5、發酵溫度32℃下枯草芽孢桿菌Bs2004菌株固態發酵產物含菌量達到9.62×109CFU·g-1。本研究通過工藝條件優化后，在初始pH 7.51、發酵溫度36.10℃、含水量26.33%時，有效活菌數可達到4.57×1010CFU·g-1。

4 結 論

本研究在單因素試驗的基礎上，采用響應面分析的方法優化固態發酵工藝，優化后的最佳工藝參數為：初始pH 7.51、KH2PO4含量0.75%、MgSO4含量0.15%、MnSO4含量0.15%、發酵溫度36.10℃、葡萄糖含量6.00%、(NH4)2SO4含量0.75%、含水量26.33%，此時固態發酵產物有效活菌數最大，為4.57×1010CFU·g-1。該結果為提高糧油加工副產物麩皮、豆粕、玉米粉的附加值，制備高效、廉價的枯草芽孢桿菌生物有機肥提供參考依據。