長期施用綠肥對小麥玉米間作土壤微生物的影響

許小虎，車宗賢，2，趙 旭，崔 恒，2，張久東，2

(1.甘肅農業大學，甘肅省農業科學院土壤肥料與節水農業研究所，甘肅 蘭州 730070；2.農業部甘肅耕地保育與農業環境科學觀測試驗站，甘肅 武威 733017)

綠肥作為一類純天然的肥料，將其翻壓還田可以有效提高土壤的有機質含量[9]，改善土壤理化性質，為微生物的生長繁殖提供良好的環境[10]。萬水霞等[11]研究表明，與不施肥的土壤相比，長期施用綠肥的土壤中微生物總量顯著增加了58.09%～86.86%，尤其是細菌數量增加了77.93%～112.76%。高菊生等[12]研究表明，與冬閑處理相比，綠肥還田能促進水稻增產，其增產穩定性較好，還能顯著增加土壤有機質含量，提高土壤全氮、堿解氮含量，加速土壤礦化，促進水稻對磷素及鉀素的吸收。李文廣等[13]研究發現，黃土高原旱地麥后復種飼料油菜還田后，有效改善了土壤細菌群落組成，增加了有益菌的豐度，酸桿菌門、芽單胞菌門以及硝化螺旋菌門豐度顯著增加。

Biolog技術由美國Biolog公司于1989年研發，能夠用于鑒定細菌、霉菌等多種微生物，并且可以判斷微生物群落的代謝活性以及生長發育情況[14]。高通量測序技術是目前應用最為普遍的測序技術，與傳統的基因測序方法相比，它具有靈敏性高、準確性高以及成本較低的特點，通過檢測土壤微生物的遺傳物質，能夠準確、全面、快速地了解土壤微生物群落的復雜性以及多樣性[15-16]。本研究基于農業部甘肅耕地保育與農業環境科學觀測試驗站長期定位試驗田(1988，灌漠土)，利用Biolog技術以及高通量測序技術研究長期施用綠肥對土壤養分、微生物代謝功能及微生物群落組成的影響，探討長期施用綠肥對土壤肥力的影響，以期為建立科學的施肥制度、提高土壤肥力提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 研究區概況

試驗地位于甘肅省武威市涼州區農業部甘肅耕地保育與農業環境科學觀測試驗站長期定位試驗田(102°40′E，38°37′N)，地處溫帶大陸性干旱氣候區，海拔1 504 m，年均氣溫7.7℃，降水量150 mm，蒸發量2 021 mm，日照時數3 023 h，無霜期約150 d。試驗地土壤為灌漠土，長期定位試驗于1988年開始，初始耕層(0～20 cm)土壤基本理化性質為：速效鉀180 mg·kg-1，pH值8.8，容重1.4 g·cm-3，孔隙度47.8%，有機質16.4 g·kg-1，全氮1.06 g·kg-1，全磷1.50 g·kg-1，有效磷13.0 mg·kg-1。

1.2 試驗設計

本研究設置了5個不同施肥處理，分別為綠肥(G)、化肥(N)、農家肥(M)、小麥秸稈(S)、不施肥(CK)，每個處理3次重復，共15個小區，隨機排列，小區面積為31.05 m2(6.9 m×4.5 m)。綠肥主要為箭筈豌豆鮮草(含有機質455～504 g·kg-1，全氮36.9～40.1 g·kg-1，全磷5.42～7.00 g·kg-1，全鉀28.4～30.3 g·kg-1)，秸稈主要為小麥秸稈；綠肥與小麥秸稈分別在前一年10月初鍘成20 cm左右的小段，翻壓在30 cm的耕層內，隨即灌水，以利腐解。農家肥為牛糞(含有機質180～220 g·kg-1，全氮1.78～2.05 g·kg-1，全磷1.83～2.58 g·kg-1，全鉀23.1～30.0 g·kg-1)，播種前將其粉碎后翻壓在30 cm的耕作層內。綠肥、小麥秸稈、農家肥全部作為基肥一次性施入土壤；化肥主要為尿素，施用方法為20%基施+80%追施。綠肥和小麥秸稈的施用量分別為每公頃農田鮮綠肥或小麥秸稈的平均產量，而化肥與農家肥的施用量為當地農戶施用肥料的最佳量。除不施肥處理(CK)外，其余處理均在小麥播種前基施磷肥(P2O5)150 kg·hm-2，除化肥處理外的其他處理全生育期不再施肥，具體施肥方案見表1。

表1 施肥方案Table 1 Fertilization scheme

供試玉米為‘利單295’，小麥為‘寧春53號’。試驗地為小麥玉米間作田(每年3月中旬播種小麥，4月中旬播種玉米，間作模式為小麥—玉米—小麥)，且每年倒茬(倒茬次序為7月底收獲小麥，10月中旬收獲玉米，收獲后統一翻地，來年種小麥的行改種玉米)。單種小麥播種量為375 kg·hm-2，帶田小麥播種量為225 375 kg·hm-2，玉米保苗67 500株·hm-2；小麥玉米帶田采用150 cm帶幅(小麥∶玉米=70 cm∶80 cm)。播種、除草、配藥、收獲等農事均為人工操作，3月中旬播種小麥，4月中上旬出苗，7月中旬收獲；4月中下旬覆膜播種玉米，5月初出苗，10月初收獲。熟制為一年一熟。

1.3 土壤樣品采集

于2020年7月小麥收獲后進行取樣，采用對角線采樣法按不同處理取0～20 cm耕層土樣3份，將3份土樣混合均勻，共計15個土壤混合樣。去除根系、枯落物，將土樣裝入滅菌自封袋中，放入裝有冰塊的保溫箱，帶回實驗室立即冷藏，一部分過篩冷凍用于測定土壤微生物，一部分自然風干常溫保存，用于測定土壤理化性質。

1.4 Biolog-ECO測定方法以及高通量測序

取10 g新鮮土壤樣品，置于已滅菌的裝有90 mL 0.85% NaCl 溶液的三角瓶中，25℃、200 r·min-1條件下振蕩30 min，并用NaCl溶液稀釋到10-3g·mL-1后，向ECO微平板的96孔中分別加入150 μL稀釋液，將接種好的Biolog-ECO板于25°C黑暗環境下培養10 d，每隔24 h在Biolog微平板讀數儀上測定590 nm與750 nm波長下吸光值，并用OD590值與OD750值的差值來表征代謝活性[17-18]。

平均顏色變化率(Average well color development,AWCD) 表示土壤微生物利用碳源的能力，采用Biolog微平板培養240 h的數據進行統計。土壤微生物群落功能多樣性指數分析采用Shannon指數、Simpson指數和McIntosh指數。

平均顏色變化率：AWCD=∑(Ci-R)/N

Shannon指數：H′=-∑pi(lnpi)

式中,Ci為第i個非對照孔的吸光值，R為對照孔的吸光值，N為微孔板中所含的31種碳源數量；ni為第i孔的相對吸光值(Ci-R)，pi為第i孔的相對吸光值與整個微平板所有相對吸光值總和的比值(Ci-R)/∑(Ci-R)。

高通量技術使用338F(ACTCCTA CGGGAGGCAGCAG)和806R(GGACTACHVGGGTW TCTAAT)對16S rRNA基因V3～V4可變區進行PCR擴增，PCR反應條件：預變性95℃ 3 min; 95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 45 s，27個循環；然后72℃穩定延伸10 min，最后10℃進行保存。用2%的瓊脂糖凝膠電泳進行檢測，并使用AXYGEN公司的AxyPrepDNA純化回收試劑盒回收。PCR回收產物后，用QuantusTM Fluorometer (Promega，USA) 對回收產物進行檢測定量。使用 NEXTFLEXRRapid DNA-Seq Kit進行建庫：(1)接頭鏈接；(2)使用磁珠篩選去除接頭自連片段；(3)利用PCR擴增進行文庫模板的富集；(4)磁珠回收PCR產物得到最終的文庫。最后將PCR產物利用Illumina公司Miseq PE300平臺(上海美吉生物醫藥科技有限公司)進行測序[19]。

1.5 土壤理化性質測定

土壤pH值采用酸度計電位法測定[20]，土壤有機質、土壤速效鉀、土壤速效磷含量分別采用重鉻酸鉀外加熱法GB 9834-88、火焰光度計法GB 7856-87、鉬銻抗比色法GB 7853-87測定[21]，土壤含水率采用烘干法測定[21]。

1.6 數據處理

利用Excel 2016以及SPSS 20.0進行數據分析，用Duncan法進行多重比較(α=0.05)。用Pearson法進行相關性分析，運用 Excel 2016及Origin 2019繪圖。土壤微生物高通量測序數據基于上海美吉生物醫藥科技有限公司云平臺(http://edu.majorbio.com/lesson/1463)進行分析。

2 結果與分析

2.1 長期施用綠肥對土壤理化性質的影響

不同施肥處理對土壤理化性質的影響如表2所示，不同施肥條件下，處理G的pH值與處理N、處理CK存在顯著性差異且前者較后2個處理分別下降了0.75%和2.86%；處理G的土壤有機質含量與處理N、處理CK存在顯著性差異，且前者較后2個處理分別高出42.64%和45.67%；處理M全氮含量高于其他處理，但各處理間差異不顯著；處理G的速效磷和速效鉀含量均顯著高于處理N和CK，速效磷分別提高了156.05%、1 233.40%，速效鉀分別提高了70.66%和16.08%；處理M的速效磷與速效鉀含量均遠高于其他處理。長期施用綠肥可有效提高土壤中的有機質、速效磷和速效鉀含量，且可以降低土壤pH值。

表2 不同施肥處理土壤理化性質(2020年)Table 2 Soil physical and chemical properties of different fertilization treatments (2020)

2.2 長期施用綠肥對土壤微生物群落結構的影響

2.2.1 對土壤微生物群落AWCD值的影響 不同處理AWCD變化曲線如圖1所示，土壤微生物對碳源的利用率隨著時間的增長而逐漸上升，且呈“S”型變化，在24～48 h內增長緩慢，48～120 h增長速度加快，168 h達到峰值后趨于穩定。因168 h為AWCD值拐點，故選取168 h的土壤微生物AWCD值進行方差分析。168 h時，處理G的AWCD值與處理N、處理CK存在顯著性差異且前者較后2個處理分別高出21.78%和32.26%；處理M與處理CK有顯著性差異，M較CK提高21.04%；不同施肥條件下的土壤微生物AWCD值表現為G>M>S>N>CK。處理G的土壤微生物AWCD值在第168 h達到最高值，且高于其他時間段的其他處理；處理G與處理M的土壤微生物AWCD值在各時間段均高于其他處理，說明長期施用綠肥可顯著提高土壤微生物的多樣性及微生物群落的活性。

圖1 平均顏色變化率Fig.1 Average color change rate

2.2.2 對土壤微生物群落多樣性指數的影響 不同處理土壤微生物的Shannon指數、Simpson指數和McIntosh指數如圖2、圖3、圖4所示。168 h時，處理M與處理N的Shannon指數之間存在顯著性差異，處理M比處理N提高了1.50%；處理G、處理S以及處理M均與處理N在Simpson指數上存在顯著性差異，3個處理分別較處理N提高了0.21%、0.17%和0.22%；處理G與處理N、處理CK的McIntosh指數之間存在顯著性差異，處理G比處理N、處理CK分別提高了18.46%和29.07%。5種不同施肥條件下，土壤微生物的Shannon指數、Simpson指數和McIntosh指數在168 h均達到了穩定，且5種處理的Shannon指數與Simpson指數在第168 h有高度一致性。24～120 h，處理N的McIntosh指數均低于處理CK。

圖2 Shannon指數變化圖Fig.2 Shannon index change chart

圖3 Simpson指數變化圖Fig.3 Simpson index change chart

圖4 McIntosh指數變化圖Fig.4 McIntosh index change chart

2.2.3 對土壤微生物碳源代謝能力的影響 如圖5所示，不同施肥處理下土壤微生物對31種碳源的利用能力存在顯著性差異。處理G的土壤微生物碳源代謝能力最強；處理G與M的土壤微生物代謝能力大于1.0的碳源最多，有28種，占總碳源的90.32%；處理N的土壤微生物代謝能力大于1.0的碳源有20種，占總碳源的64.52%；處理CK僅有14種，占總碳源的45.16%。各個處理均對4-羥基苯甲酸、r-羥基丁酸、L-精氨酸、L-天冬酰胺酸以及衣康酸有著較高的利用能力，而均對a-丁酮酸、D,L-a-甘油、甘氨酰-L-谷氨酸利用率較差。

圖5 微生物168 h碳源利用聚類熱圖Fig.5 Clustering heatmap of microbial 168 h carbon source utilization

處理N與處理CK的土壤微生物對酯類、醇類以及一些氨基酸類的利用率較差，對葡萄糖-1-磷酸鹽、L-蘇氨酸、L-絲氨酸、D-半乳糖酸γ內脂、I-赤藻糖醇、2-羥苯甲酸、腐胺利用率均低于其他處理；處理G對酸類碳源的利用明顯高于其他處理；處理G與處理M的土壤微生物對L-苯基丙氨酸的利用率明顯高于其他處理。可見，處理G與M對土壤碳源的代謝能力最強。

通過聚類分析可以看出，處理G與M的土壤微生物對碳源的代謝能力相似，處理N與CK的土壤微生物對碳源的代謝能力相似；通過聚類分析將碳源分為6類，土壤微生物對酸類碳源與單糖/糖苷/聚合糖類碳源的利用情況相似，而對胺類、酯類以及醇類碳源利用情況相似。

2.2.4 土壤微生物群落的Alpha多樣性分析 利用生信云平臺對原始測序數據進行質量控制，從15個土壤樣品中共獲得647 949條高質量且有效的細菌基因序列，通過97%的OTU聚類后獲得4 640個細菌OTUs。由表3可知，不同施肥條件下0～20 cm土層土壤樣本Shannon指數大體相似；Coverage指數均大于0.97，說明各個土壤樣本中基因序列被檢出率很高，能夠正確合理地反映各個土壤樣本中細菌群落的多樣性情況；處理G與處理N、處理CK在Simpson指數上存在顯著差異，表明在不同類型施肥土壤樣本中細菌群落多樣性存在顯著差異，表現為G>CK>N；處理G、處理S、處理M的OTU數目均明顯高于處理N；處理N和處理CK的ACE指數和Chao1指數均低于其他3個處理。

表3 各土壤樣品微生物多樣性指數表Table 3 Microbial diversity index of soil samples

2.2.5 對土壤細菌門水平上群落結構的影響 將各處理土壤樣品中得到的OTU，在不同水平上進行物種注釋，選取相對豐富度大于1.0%的細菌門分析樣品中細菌群落的組成。如圖6所示，不同施肥條件下土壤細菌門水平的群落結構基本一致，包括11個細菌門：Actinobacteriota、Proteobacteria、Acidobacteriota、Chloroflexi、Firmicutes、Bacteroidota、Myxococcota、Gemmatimonadota、Planctomycetota、Methylomirabilota和Nitrospirota；其中Actinobacteriota、Proteobacteria、Acidobacteriota、Chloroflexi、Firmicutes為優勢菌門。處理G中放線菌門(Actinobacteria)的相對豐度最高，占總豐度的29.95%，分別比處理CK和處理N提高了21.35%和16.86%；變形菌門(Proteobacteria)相對豐度占20.45%，略高于處理N與處理CK；酸桿菌門(Acidobacteriota)相對豐度最低，占13.39%，而處理CK與處理N最高，分別占19.71%和18.23%；綠彎菌門(Chloroflexi)占比也較低，為11.4%，而處理CK與處理N的相對豐度分別為14.56%和13.43%。處理M的厚壁菌門(Firmicutes)相對豐度最高，為12.98%，處理CK最低，為3.54%，而處理G的相對豐度明顯高于處理CK與處理N。

圖6 不同施肥條件下各土壤細菌群落在門水平的相對豐度Fig.6 Relative abundance of soil bacterial communities at phylum level under different fertilization conditions

不同施肥條件下，長期施用綠肥處理的變形菌門(Proteobacteria)相對豐度高于其他處理，酸桿菌門(Acidobacteriota)、綠彎菌門(Chloroflexi)的相對豐度則表現出相反的變化趨勢。擬桿菌門(Bacteroidota)、粘球菌門(Myxococcota)、芽單胞菌門(Gemmatimonadota)、硝化螺旋菌門(Nitrospirota)等在長期不同施肥條件下土壤中的相對豐度變化不明顯。此外，厚壁菌門(Firmicutes)僅在施用農家肥以及綠肥的土壤中大量存在，分別占總豐度的12.98%和7.29%，其他施肥土壤中豐度不足4.00%。

2.2.6 對土壤細菌屬水群落結構的影響 對不同處理土壤細菌OTU豐度排名前20的屬進行聚類分析，如圖7所示，處理G增加了芽孢桿菌屬(Bacillus)、斯科爾曼菌屬(Skermanell)、假節桿菌屬(Pseudarthrobacter)豐度，分別比處理N提高了126.06%、65.27%和317.12%；處理G還增加了鏈霉菌(Streptomyces)和類諾卡氏菌(Nocardioides)的豐度，分別比處理N提高了43.12%和27.01%。而處理G中OTU>500的有10類，處理CK中有12類，處理N中有11類。除了不施肥對照與單施氮肥處理，其他3種施肥處理均降低了RB41的豐度。未鑒別的細菌種類在各個土壤樣本中也以極高的豐度水平存在。通過聚類分析可以看出，處理N與處理CK對土壤細菌群落屬水平上影響情況類似，處理S與處理M情況類似；而從細菌種類的角度來看，芽孢桿菌屬(Bacillus)、蓋拉菌屬(Gaiella)以及芽生球菌屬(Blastococcus)在不同施肥條件下相對豐度情況類似，相對豐度較高；類諾卡氏菌屬(Nocardioides)、鞘氨醇單胞菌屬(Sphingomonas)以及斯科爾曼菌屬(Skermanella)情況類似，相對豐度均較低。

注：norank_f_...代表目前未鑒別的細菌種類。Note: norank_ f_... represents currently unidentified bacterial species.圖7 不同施肥條件下各土壤細菌群落在屬水平聚類熱圖Fig.7 Heatmap of soil bacterial communities at genus level under different fertilization conditions

2.2.7 不同施肥處理土壤微生物β多樣性分析 不同施肥條件下土壤細菌門水平主坐標分析(PCoA)如圖8所示，第1主坐標軸(PC1)與第2主坐標軸(PC2)對樣本組成差異的解釋度分別為47.59%和26.69%，2個主坐標軸累積解釋度達74.28%，說明其可以代表土壤微生物門水平群落組成的特征。處理G與處理CK、處理N在PC1軸上明顯分開，而處理M與其他樣本在PC2軸上明顯分開，說明處理G與CK、N在土壤細菌微生物群落結構上存在顯著差異，而處理M與其他處理存在顯著差異。

圖8 不同施肥條件下土壤細菌門水平群落主坐標分析(PCoA)Fig.8 Principal coordinate analysis of horizontal community of soil bacteria on phylum level under different fertilization conditions (PCoA)

2.3 長期不同施肥條件下環境因子對土壤細菌群落的影響

2.3.1 基于Biolog-ECO長期不同施肥對土壤微生物群落多樣性的影響 為了進一步研究土壤微生物群落與環境因子之間的相關性，采用r語言中Vagen法進行RDA分析，結果如圖9所示。各指標用帶箭頭的矢量線表示，連線的長短表示微生物群落特征與該環境因子相關系數的大小，箭頭連線與排序軸的夾角表示該環境因子與排序軸的相關性，與排序軸的夾角越小，該指標與排序軸的相關性越大[22]。從圖9可以看出，6個環境因子對微生物群落的影響均表現出顯著性，RDA1和RDA2解釋率分別為66.45%和2.95%，其中對微生物群落影響最大的環境因子是pH值(r2=0.5651，P=0.0048)和有機質OM(r2=0.4038，P=0.400)。

注：OM—有機質；TN—全氮;AP—速效磷;AK—速效鉀；SWC—土壤含水率。下同。Note: OM-Organic matter; TN-Total N; AP-Available P; AK-Available K; SWC-Soil water content. The same below.圖9 Biolog-ECO與環境因子的RDA分析(箭頭代表環境因子)Fig.9 RDA analysis of Biolog-ECO and environmental factors (the arrow represents environmental factors)

2.3.2 土壤細菌在門水平下基于高通量的db-RDA分析 土壤理化性質與細菌門水平的關系如圖10所示，不同處理的微生物群落分別聚集在不同位置，表明不同處理之間土壤微生物群落存在顯著差異。環境因子對不同施肥處理土壤微生物的影響不同。pH值與有機質對土壤細菌群落的影響最大；速效磷、速效鉀、含水率、全氮與pH值之間的夾角為銳角，除速效磷之外其他環境因子與pH值之間的夾角為鈍角，說明這幾種環境因子之間是正相關關系；有機質與pH值之間的夾角為鈍角，兩者之間呈負相關關系；速效磷與有機質之間呈正相關關系。其中速效鉀、含水率、全氮以及pH值與處理N和處理CK的土壤樣本細菌群落結構存在較大的正相關性，而有機質與處理G和處理M的土壤樣本細菌群落結構存在較大的正相關性。

2.3.3 長期不同施肥條件下細菌門水平群落相對豐度與環境因子的相關性 選取細菌門水平上豐度前10的物種，采用Spearman相關性系數，分析細菌種類與環境因子之間的相關性。結果表明(圖11)，土壤速效磷、速效鉀、有機質以及全氮的含量是影響細菌群落結構在門水平上最主要的環境因子。芽單胞菌門(Gemmatimonadota)和甲烷氧化菌門(Methylomirabilota)的群落相對豐度與有機質、全氮、速效磷和速效鉀存在顯著負相關；厚壁菌門(Firmicutes)與有機質、全氮、速效磷、速效鉀以及含水率存在顯著性正相關，酸桿菌門(Acidobacteriota)和甲烷氧化菌門(Methylomirabilota)與pH值存在顯著正相關。

注：X軸與Y軸分別為環境因子和不同物種，計算Spearman相關性系數R值和顯著性P值，R值在圖中用不同顏色顯示，而P值用星號顯示。*代表P<0.05，**代表P<0.01，***代表P<0.001。Note: X-axis and Y-axis are environmental factors and different species respectively. Calculate Spearman correlation coefficient R value and significance P value. R value is displayed in different colors in the figure, while P value is displayed with asterisk. * represents P<0.05, ** represents P<0.01, *** represents P<0.001.圖11 細菌門水平與環境因子之間的相關性熱圖Fig.11 Heatmap of correlation between bacterial phylum />and environmental factors

3 討 論

微生物是土壤生態的重要組成部分，其活性與土壤肥力密切相關。本研究發現長期施用綠肥有效提高了土壤微生物的種類和數量，與多位學者的研究結果相似[23-26]。AWCD值反映微生物群落的代謝活性，是指示微生物分解代謝能力的重要指標[27]。本研究表明，長期施用綠肥和農家肥處理的AWCD值顯著高于其他施肥處理，施用綠肥以及農家肥可以增加植物的凋落物和根系分泌物，補充土壤的有機質，進而提高土壤微生物的代謝活性[28-29]。

Simpson指數和Shannon指數是表征微生物功能多樣性的指標[30]。長期施用綠肥和農家肥可顯著提高土壤微生物群落多樣性。呂卓呈等[31]研究發現綠肥還田為土壤微生物提供了大量的碳源和氮源，能夠有效提高土壤微生物的Shannon指數和Simpson指數。在本研究當中，處理G在微平板培養168 h時Simpson指數較處理N顯著提高了0.21%，而Shannon指數兩者基本沒有差異，說明群落多樣性差異不大。Sun等[32]研究發現長期單施化肥會導致土壤微生物群落多樣性降低，而李猛等[33]研究發現，長期單施氮肥會導致土壤中微生物的種類和數量減少，微生物整體代謝功能明顯下降，常見菌群的均勻度也低于其他處理。本研究中處理N與處理CK的3種指數(Shannon指數、Simpson指數和McIntosh指數)結果相差不大，處理N的AWCD值均低于其他處理；處理G與處理N在McIntosh指數存在顯著性差異，前者較后者提高了18.46%，說明單施氮肥降低了土壤微生物活性及多樣性，且會導致菌群均勻度降低。通過對不同施肥條件下土壤微生物的Shannon指數與Simpson指數進行分析發現，處理N的Shannon指數和Simpson指數一直低于其他4個處理的平均水平，這可能是由于農家肥、綠肥施入帶來大量可被微生物利用的碳源和氮源，刺激了土壤微生物的生長；農家肥的施入帶來大量的活性微生物，起到了“接種”的作用，促進了微生物生長以及其活性增加[34]。綠肥在施入土壤后會被腐解，腐解過程中養分釋放速度較為緩慢，可以滿足作物長期生長過程中的養分需求，不僅能提高作物產量和養分利用率，還可以降低養分的淋溶損失[35]。羅希茜等[36]研究表明長期秸稈還田以及習慣施肥會導致微生物群落均勻度降低，與本研究處理S的McIntosh指數結果一致。通過微生物培養168 h碳源利用聚類分析熱圖來看，處理G的土壤微生物碳源代謝能力最高，且對酸類碳源的利用率明顯高于其他處理；通過聚類分析可以看出一些酸類、氨基酸類以及單糖/糖苷/聚合糖類碳源在5種不同處理下土壤微生物利用率較高；而各處理均對a-丁酮酸、D,L-a-甘油、甘氨酰-L-谷氨酸利用率較差。

從細菌群落門水平上的分布來看，長期施用綠肥與其他施肥條件的土壤細菌群落組成一致，但是各門類細菌的豐度大小存在差異。李秀英等[37]研究表明，長期單施化肥會導致土壤細菌數量低于荒地，如土壤固氮菌、反硝化細菌、纖維分解菌等，而土壤放線菌和硝化細菌會增加。本研究中，放線菌門、變形菌門、酸桿菌門、綠彎菌門在各個土壤樣本中均大量存在，為土壤優勢菌群；處理G放線菌門豐度最高，占29.94%，且處理G相比處理N放線菌門豐度提高了16.86%。呂卓呈等[31]研究表明長期施用綠肥可以有效提高土壤細菌OTU數量；與其他施肥條件相比，處理G土壤樣本中的放線菌門豐度提高7.01%，細菌的OTU數量相比施用化肥處理提高了1.92%。鄒湘等[38]研究表明不施肥與化肥配施豬糞的土壤細菌群落聚類更接近，本研究也發現單施化肥與不施肥的土壤細菌群落結構相似；韓梅等[39]研究表明，長期化肥、綠肥配施提高了土壤微生物群落的穩定性，并且使得變形菌門與酸桿菌門成為優勢菌種；變形菌門是一種在土壤中大量存在的富營養微生物，很多種類的變形菌都可以在土壤中起固氮作用[40]。本研究各施肥處理的土壤中變形菌門種類豐度均高于不施肥對照，說明長期施肥有利于土壤固氮以及土壤微生物群落的穩定。宋兆齊等[41]研究表明厚壁菌門有很強的適應能力，能夠降解土壤中一些難溶化合物，并且可以有效防治一些植物病蟲害，在土壤生態環境中發揮著重要作用；長期施用農家肥和綠肥的土壤樣本中，厚壁菌門分別占總豐富度的12.98%和7.29%。長期施用綠肥能有效提高土壤質量以及土壤肥力。酸桿菌門在土壤生態系統中有著重要的作用。本研究表明，施綠肥和施農家肥的土壤中酸桿菌門的豐度低于其他施肥條件下的土壤，且土壤168 h熱圖中綠肥處理明顯提高了酸類碳源的利用率，這可能是由于綠肥與農家肥中某些物質增加了土壤堿性，或者是施用綠肥導致酸類碳源被其他微生物大量利用而影響了酸桿菌門的生長發育，導致其豐度降低。細菌群落在屬水平上的Heatmap圖(圖7)表明，不同處理土壤細菌群落在屬水平上組成基本一致。芽孢桿菌是一種具有解磷、解鉀、固氮等生物活性的微生物，有利于提高作物產量，且芽孢桿菌抗逆性好。在李彥林等[42]的研究中，耕地中的優勢菌屬為芽孢桿菌屬、葡萄球菌屬、假節桿菌屬等，耕地微生物數量大于其他類型土壤微生物數量。趙冬雪[43]研究表明長期施用綠肥會導致土壤中芽孢桿菌屬水平提高；本研究表明長期施用綠肥有效增加了芽孢桿菌的豐度，比單施氮肥處理提高了126.06%，與其研究結果一致。這可能是由于綠肥翻壓還田后增加了土壤中的磷、氮等元素含量，進而提高了芽孢桿菌的豐度。長期施用綠肥有效提高了假節桿菌屬的含量，比單施氮肥處理提高了317.12%，假節桿菌屬有利于有機物的降解，提高了土壤養分含量以及土壤肥力。總體來看，長期施用綠肥有效提高了土壤中有益菌的含量，從而提高了土壤肥力，有利于作物的生長。

對Biolog-ECO檢測以及高通量測序后的數據進行RDA相關性及相關性熱圖分析，可以看出，pH值與有機質是影響土壤微生物群落多樣性的最主要環境因素；土壤全氮、pH值、土壤速效鉀以及含水率之間呈顯著正相關(P<0.05)，而綠肥主要為豆科作物，能大量固定空氣中的氮，通過其翻壓還田，可有效增加土壤氮含量。氮素的增加可以極顯著地提高土壤速效磷、速效鉀含量以及土壤含水率，有利于土壤肥力的增加。Biolog-ECO[30]和高通量測序方法對微生物群落多樣性分析的側重點不同，Biolog-ECO主要分析微生物的代謝活性，而高通量測序主要分析土壤中所有微生物基因的多樣性。本研究結果表明綠肥以及農家肥有利于土壤肥力的提高，兩種方法相互印證，如Biolog-ECO分析得出施綠肥使得酸類碳源的利用率較高，而高通量測序結果分析得出施用綠肥導致酸桿菌門相對豐度降低。土壤微生物的群落結構和豐度與有機質、氮、磷、鉀含量及pH等土壤理化因子均呈現顯著相關性，這些理化因子的改變對微生物群落變化有明顯影響[44]。

4 結 論

1)長期施用綠肥有利于提高土壤微生物群落的多樣性，單施氮肥降低了土壤微生物的多樣性，綠肥處理相比氮肥處理的McIntosh指數提高了18.46%。

2)單施氮肥降低了土壤微生物對單糖/糖苷/聚合糖類的代謝能力，長期施用綠肥可以增強土壤微生物對碳源的代謝能力，且顯著提高了對酸類碳源的利用，降低了土壤中酸桿菌門的豐度。

3)與單施氮肥相比，長期施用綠肥土壤中放線菌門的豐度提高了16.86%，芽孢桿菌屬、厚壁菌門、鏈霉菌屬的相對豐度也有所提高，從而提升了土壤抵御土傳病害的能力。