甘草次酸介導的馬錢子堿自組裝納米粒的體內藥動學研究

管慶霞，周小影，劉宇萌，于欣，趙芳園（.黑龍江中醫藥大學，哈爾濱 50040；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，哈爾濱 50040）

甘草次酸（GA）及其衍生物的抗腫瘤作用已被廣泛研究。GA可通過誘導細胞周期阻滯和激活半胱天冬酶依賴途徑來誘導肝癌細胞凋亡，還通過下調血管內皮生長因子（VEGF）、淋巴管內皮透明質酸受體1（LYVE-1）和基質金屬蛋白酶-2（MMP-2）蛋白的表達來抑制肝癌的血管化和淋巴轉移[1-2]。聚乙二醇（PEG）修飾的納米給藥系統可延長納米粒在體內的循環時間，且透過細胞膜的能力增強。細胞內外存在氧化還原電位，而二硫鍵能夠在細胞外環境中穩定存在，在還原性的細胞內環境中被谷胱甘肽（GSH）還原，腫瘤細胞中GSH的濃度比細胞外及正常細胞均較高，能夠提供還原環境，使得二硫鍵發生斷裂，實現高效釋藥的目的[3-4]。

馬錢子堿具有抗炎、抗腫瘤及增強機體免疫力等作用，是一種高效的抗腫瘤單體，但水溶性差、具有毒性等缺點制約了其在臨床上的應用[5-6]。如何將藥物靶向于肝，使其更好地發揮療效，已成為目前亟需攻克的難題。

本試驗基于GA的肝靶向性及抗腫瘤的藥理作用，PEG長循環特性及二硫鍵細胞內可斷裂特點，將GA、PEG以及二硫鍵進行制備，構建GA介導的馬錢子堿自組裝納米粒，以期提高馬錢子堿生物利用度，發揮長效作用。采用HPLC法建立馬錢子堿在血漿中含量測定的體內分析方法，經尾靜脈注射后在不同時間點大鼠眼眶取血，HPLC含量測定后DAS 2.0軟件對藥時數據進行方程擬合，得出藥動學參數，從而分析體內藥動學差異。

1 儀器與試藥

DF-101Z恒溫磁力攪拌器（鄭州長城科工貿有限公司）；氮氣吹干儀（BFC八方世紀）；微型渦旋混合器（上海滬西分析儀器廠有限公司）；e2695-2698高效液相色譜儀（美國Waters公司）；離心機（上海安亭科學儀器廠）；超聲波清洗機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；十萬分之一分析電子天平（瑞士METTLER TOLEDO公司）；微量移液器（大龍合資）。

肝素鈉注射液（江蘇萬邦生化醫藥股份有限公司，批號：1209124，規格：2 mL：12 500 U）；B-GPSG-NPs凍干品、B-PSG-NPs凍干品（自制，載藥量約2.58%）；羥基酪醇（HT）對照品（批號：20130301，蘇州皓翔化學科技有限公司）、馬錢子堿對照品（批號：110706-200505，純度均＞98%，中國食品藥品檢定研究院）。

SPF級SD大鼠，雌雄各半（200±20）g（批準文號2016101601，黑龍江中醫藥大學試驗動物中心）。

2 方法與結果

2.1 GA介導的馬錢子堿自組裝納米粒的制備及表征

2.1.1 GA介導的馬錢子堿自組裝納米粒的制備 課題組前期通過酰胺、酯化等方法將GA、PEG以及二硫鍵進行制備，構建出GA介導的馬錢子堿自組裝納米粒載體；溶劑乳化超聲法制備GA介導的馬錢子堿自組裝納米粒；制備成B-GPSG-NPs凍干粉[7]，GA介導的馬錢子堿自組裝納米粒結構如圖1所示。

圖1 GA介導的馬錢子堿自組裝納米粒結構圖Fig 1 Structure of GA-mediated brucine self-assembled nanoparticles

2.1.2 GA介導的馬錢子堿自組裝納米粒的表征

① 外觀：B-GPSG-NPs凍干粉，外觀均為白色疏松的固體粉末，色澤均勻，外觀飽滿且光潔細膩，輕輕振搖后能成塊脫落，見圖2。

圖2 納米凍干粉Fig 2 Freeze-drying powder of B-GPSG-NPs

② 形態觀察：將B-GPSG-NPs凍干粉復溶后，經0.45 μm濾膜過濾，滴入覆有支持膜的銅網上，吸去過量液體，自然干燥，隨后滴加濃度為2%的磷鎢酸溶液，染色2～3 min，自然干燥，置于透射電子顯微鏡（TEM）下觀察并拍照。結果見圖3。凍干后粒徑和形態基本沒有變化，為分散均勻的圓球形納米粒。

圖3 B-GPSG-NPs透射電鏡照片Fig 3 B-GPSG-NPs by TEM

③ 再分散性：取適量B-GPSG-NPs凍干粉樣品3批，加入適量注射用水進行復溶，經數次輕輕振搖后，很快分散成均勻淡藍色的納米粒溶液，說明B-GPSG-NPs凍干粉再分散性良好（見圖4）。④ 粒徑及Zeta電位：取B-GPSG-NPs凍干粉用注射用水復溶后，得到納米溶液，測定粒徑及Zeta電位。結果其粒徑為（108.91±8.62）nm，Zeta電位為（-19.63±3.40）mV，PDI為（0.187±0.005），粒徑分布及電位見圖5。

圖4 B-GPSG-NPs凍干品復溶后的外觀圖Fig 4 B-GPSG-NPs after re-dissolving

圖5 粒徑分布圖及電位圖Fig 5 Particle size distribution and Zeta potential

⑤ 包封率及載藥量的測定

采用低溫超速離心法：量取3批B-GPSG-NPs溶液置于離心管中，超速離心（15 000 r·min-1，30 min），將沉淀的納米粒收集，再用蒸餾水超聲使其分散，繼續離心，重復3次，取沉淀部分。精密量取B-GPSG-NPs混懸液，加色譜甲醇超聲20 min（頻率：40 kHz，功率：200 W），使納米粒破乳，將包載的藥物充分釋放，過0.22 μm微孔濾膜，即得B-GPSG-NPs供試品溶液。同法制備不加藥物的GPSG空白納米粒溶液。過0.22 μm微孔濾膜，在流動相為甲醇-（水-乙酸-三乙胺＝230∶2.4∶0.3）（30∶70）；色譜柱為Dikma C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長265 nm；流速1 mL·min-1；進樣量20 μL；柱溫30℃條件下進樣測定，計算包封率以及載藥量。結果包封率及載藥量分別為（68.37±1.83）%和（1.86±0.05）%，均略有增加，RSD均小于5%，與前期相比，重現性良好，工藝可行。

⑥ 穩定性評價：配制0.0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mol·L-1的Na2SO4溶液，制備GPSG空白納米粒，取0.5 mL的GPSG空白納米粒溶液加入至2.5 mL不同濃度的Na2SO4溶液中，37℃靜置10 min，560 nm波長處紫外檢測各個樣品的吸光度值，進行濃度-吸光度曲線的繪制，用于納米粒的穩定性評價。

GPSG納米粒與一系列濃度的Na2SO4溶液作用后的吸光度變化曲線見圖6。由圖6可知，當Na2SO4濃度低于0.7 mol·L-1時，體系的吸光度幾乎沒有變化，而當電解質濃度繼續增加后，體系的吸光度突然增大，這可能由于隨著電解質濃度的進一步增加，納米粒子穩定性降低，體系吸光度發生突變。其臨界絮凝濃度為0.7 mol·L-1，遠遠大于人體血液中的電解質濃度（主要成分為0.14 mol·L-1的鈉離子和0.10 mol·L-1的氯離子），表明納米粒子在電解質水溶液中具有高度的穩定性。

圖6 納米粒穩定性Fig 6 Stability of nanoparticles

2.2 體內藥動學分析方法的建立

2.2.1 色譜條件 流動相為甲醇-（水-乙酸-三乙胺＝230∶2.4∶0.3）（30∶70）；色譜柱為Dikma C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；檢測波長：265 nm；流速：1 mL·min-1；進樣量：20 μL；柱溫：30℃。

2.2.2 血漿樣品的處理 取大鼠血漿250 μL，加入內標（20 μg·mL-1羥基酪醇甲醇溶液）20 μL，加入100 μL的NaOH溶液（1 mol·L-1），渦旋1 min，超聲20 min，放入2 mL萃取劑（二氯甲烷∶甲醇＝9∶1），渦旋5 min，超聲溶解20 min，離心5 min（轉速5000 r·min-1），收集下層液，上層血漿繼續加2 mL萃取劑，重復上述操作，合并下層液，置于37℃水浴氮氣吹干，用200 μL色譜甲醇復溶，渦旋2 min，12 000 r·min-1離心10 min，取上清液進樣測定。

2.2.3 專屬性考察 取空白血漿、含馬錢子堿對照品和內標物羥基酪醇對照品的血漿、尾靜脈注射馬錢子堿后的血漿樣品，按“2.2.2”項下方法進行處理，結果見圖7，血漿樣品處理的過程中未引入干擾物質，馬錢子堿與內標羥基酪醇的分離度良好，血漿的內源性物質對測定無干擾。

圖7 高效液相色譜圖Fig 7 HPLC chromatogram

2.2.4 線性關系的考察

① 馬錢子堿溶液的配制：稱取馬錢子堿對照品2.60 mg置于25 mL量瓶中，用適量甲醇定容，即得質量濃度為104 μg·mL-1的對照品溶液，備用。

② 標準曲線的繪制：將馬錢子對照品溶液，用空白大鼠血漿逐級稀釋得到0.65、3.25、6.50、13.00、26.00、52.00 μg·mL-1系列質量濃度的對照品溶液，按“2.2.2”項下方法處理，橫坐標（X）為血漿中馬錢子堿質量濃度，縱坐標（Y）為對照品與內標物峰高之比，用加權最小二乘法進行回歸運算，得標準曲線方程為Y＝0.038X+0.082，R2＝0.9986，馬錢子堿在0.65～52.00 μg·mL-1內與峰面積呈良好的線性關系。

2.2.5 精密度考察 精密量取馬錢子堿供試品溶液200 μL（40.00、20.00、4.00 μg·mL-1），揮干有機溶劑加入等量空白血漿，按“2.2.2”項下方法處理后進樣分析，記錄峰面積，在日內、日間分別測定6次，考察其精密度。結果表明，日內與日間精密度RSD均小于10%，符合方法學要求。

2.2.6 穩定性考察 精密量取等量馬錢子堿供試品溶液，分為高、中、低3個濃度（40.00、20.00、4.00 μg·mL-1）（n＝6），氮氣揮干，將適量的空白血漿加入其中，室溫靜置6、12、24 h，分別取樣并冷凍；間隔1、2、3周后取樣，按血漿樣品的處理和進樣分析，記錄峰面積，結果RSD均小于5%，符合方法要求。

2.2.7 檢測限及定量限 將馬錢子堿對照品溶液不斷稀釋后進行分析，測得馬錢子堿對照品溶液測定的檢測限為0.428 μg·mL-1，定量限為0.650μg·mL-1。由此可見，該方法的靈敏度較高，能滿足馬錢子堿含量測定的要求。

2.2.8 回收率考察 精密量取52、13、0.65μg·mL-1的馬錢子堿供試品溶液200 μL，各3份揮干有機溶劑，加入等量空白血漿，按“2.2.2”項下方法處理，進樣分析，記錄峰面積。馬錢子堿峰高與未經提取的相同量對照品（甲醇液）的峰高比較，得馬錢子堿的絕對回收率；另將馬錢子堿與羥基酪醇峰高之比代入標準曲線方法，計算測得藥物濃度，與加入量比較，考察樣品的方法回收率，結果見表1，符合生物樣品的測定要求。

表1 回收試驗結果(x±s，n＝3)Tab 1 Recovery (x±s，n＝3)

2.2.9 體內藥動學研究

① 動物分組及給藥：取18只健康大鼠，雌雄各半，隨機分成3組，分別為原料藥馬錢子堿溶液組，B-GPSG-NPs溶液組以及B-PSG-NPs溶液組，于給藥前的12 h進行禁食不禁水，采用尾靜脈推注給藥的方式，每組注射馬錢子堿的劑量均為10 mg·kg-1。分別于給藥后的不用時間點進行取血（眼底靜脈叢毛細血管取血），取血時間點為10、30、60、90、120、150、180、210、240、300、420、600 min，取血量約為0.5 mL，隨后置于涂有肝素鈉的尖底離心管（規格：1.5 mL）中，6000 r·min-1離心10 min，取上層血漿，按“2.2.2”項下方法處理，進樣分析，計算血藥濃度。

② 血藥濃度-時間：分別在給藥后各時間點取血，進樣測定后計算血藥濃度。馬錢子堿溶液組，B-PSG-NPs溶液組以及B-GPSG-NPs溶液組各時間點的馬錢子的血藥濃度值繪制三組的平均血藥濃度-時間曲線，見圖8。

圖8 馬錢子堿溶液組，B-PSG-NPs溶液組，B-GPSG-NPs溶液組中馬錢子堿的血藥濃度-時間曲線Fig 8 Plasma concentration-time curves of brucine in the brucine group，the B-PSG-NPs group and the B-GPSG-NPs group

由圖8可知，B-GPSG-NPs溶液組與B-PSGNPs溶液組顯著提高馬錢子堿在體內的血藥濃度；顯著延長了馬錢子堿在體內的時間。B-GPSG-NPs經GA介導，較未介導的B-PSG-NPs不僅提高了血藥濃度還延長了作用時間。

③ 藥動學參數：通過運用DAS 2.0軟件對所得進行血藥濃度-時間曲線擬合，結合F檢驗，根據AIC值最小和擬合優度最優原則，可判定大鼠尾靜脈注射馬錢子堿溶液組、B-GPSG-NPs溶液組以及B-PSG-NPs溶液組后的血藥濃度-時間曲線均符合權重因子為1/C2的二室模型，藥動學參數見表2。

由表2可知，與馬錢子堿溶液組相比，BGPSG-NPs溶液組和B-PSG-NPs溶液組AUC、tl/2α和t1/2β均顯著增加，CL大大降低。B-GPSGNPs溶液組中藥物的tl/2α、t1/2β分別是馬錢子堿溶液組中藥物的3.11、2.18倍，AUC值是溶液組中藥物的3.7倍，血漿清除率是溶液組的0.31倍。B-PSG-NPs溶液組中藥物的tl/2α、t1/2β分別是馬錢子堿溶液組中藥物的1.5、1.7倍，AUC值是溶液組中藥物的3.2倍，血漿清除率是溶液組的0.36倍。

B-GPSG-NPs溶液組和B-PSG-NPs溶液組均改變了馬錢子堿的藥動學參數，B-GPSG-NPs溶液組效果更好，藥物在大鼠體內的半衰期和體內滯留時間更長，更有助于提高藥物的生物利用度，發揮長效作用。

3 小結

GA介導的馬錢子堿自組裝納米粒的體內藥動學研究結果表明，B-GPSG-NPs溶液組、B-PSG-NPs溶液組與馬錢子堿原料藥組相比，馬錢子堿溶液組在180 h，基本已代謝完全，而B-PSG-NPs溶液組以及B-GPSG-NPs溶液組藥物在體內的作用時間延長，分別為420 h和600 h，達到長效緩釋的效果，但B-GPSG-NPs溶液組更為長效，原因可能是GPSG載體有效地保護了藥物，避免被酶類分解，有助于藥物生物利用度的提高，從而達到長效的作用；也有可能是GA水解后可生成18β-甘草次酸（β-GA），具有較大的位阻效應，對代謝具有一定影響，從而使其半衰期延長[8]。綜上，若進一步優化及研究，GA介導的馬錢子堿自組裝納米粒將有成為臨床抗腫瘤治療新劑型的潛力，對臨床治療有巨大的研究意義。