蜜蜂生殖細胞的超低溫冷凍方法

莊明亮 李劍飛 李志勇 王志 葛蓬│文

吉林省養蜂科學研究所，吉林 132108

蜜蜂是重要的社會性昆蟲，占授粉昆蟲總數的80%，具有巨大的生態和經濟價值，且是實現農業綠色發展的重要一環。我國擁有豐富的蜜蜂遺傳資源，然而，在過去十年里全球范圍內蜜蜂種群受到巨大威脅，包括來自自然環境、農藥、寄生蟲等因素[1]，蜜蜂珍惜種質資源的保護和開發利用顯得尤為重要。超低溫冷凍蜜蜂生殖細胞技術不受地域、時間和蜂王壽命的限制，為蜜蜂種質資源的保護開辟了新途徑。

利用低溫冷凍技術保存生物資源由來已久，1776年，Sallanzani 利用雪冷凍馬的精子即是這方面最早的記載，1951年Stewart 用冷凍精液授精成功生下一頭牛犢[2]，這是世界第一例使用冷凍的精液授精并成功的案例，1964年Sawada 等首先利用甘油作為冷凍保護劑能夠將蜜蜂精液冷凍保存成功[3]。蜜蜂生殖細胞低溫冷凍保存技術發展到今天，根據冷凍過程中降溫速率不同可分為2 種：第一種是逐步降溫冷凍法（程序化冷凍法），第二種是玻璃化冷凍法。

一、冷凍機理

逐步降溫法采用分步降溫，先將保存材料慢速降溫至置核溫度，再放入液氮中保存。該法適用于單細胞、少細胞或含單一細胞類型的生物材料，蜜蜂精液的冷凍保存多采用逐步降溫法。精液冷凍溫度降低過程，精子膜的完整性受到冰晶的破壞，導致細胞內酶、脂類、各種離子釋放從而對精子造成損傷，這個時期的控制好低溫速率和投入液氮時精液溫度才能減小冰晶化對精子的損傷[4]。

玻璃化冷凍保存是指以非常快的速率將保存材料降溫至液氮及液氮溫度以下時，出現非晶態的現象，這種非晶態被稱為玻璃態[5]。玻璃化冷凍方法是通過使用高濃度的冷凍保護劑使細胞脫水，0℃以上直接投入液氮中，使冷凍材料快速冷卻（15,000 ～30,000℃/min），液體粘度增加，當達到臨界值時發生凝固化，避免了細胞內冰晶的形成。該法適用于些多細胞類型的復雜生物材料，蜜蜂的胚胎多采用玻璃化冷凍法。

二、冷凍降溫方法

1.冷凍前的滲透化處理

蜜蜂的胚胎外層有保護結構，保護劑無法滲入，所以采用玻璃化冷凍方法冷凍蜜蜂胚胎時必須要有去除保護結構的滲透化處理，而冷凍蜜蜂精液則無需滲透化處理。對滲透起主要障礙的是蜜蜂的外卵殼和蠟質層，外卵殼是有多種蛋白組成的網格狀結構，蠟質層主要由脂類物質構成。

目前滲透化處理的方法有機械去除法[6]、酶消化法[7]、次氯酸鈉和鏈烷烴類并用法[8]。機械去除法者需很高的操作技巧，且易對胚胎造成致死性機械損傷，酶消除法處理時間較長且成本較高。蜜蜂胚胎的滲透化處理采用次氯酸鈉和鏈烷烴類并用法，用2%～5%的次氯酸鈉去除蜜蜂胚胎的外卵殼，再用庚烷或正己烷去除蠟質。

2.加入冷凍保護劑

根據冷凍保護劑能否進入細胞內部分為滲透性保護劑和非滲透性保護劑。滲透性保護劑能夠進入細胞內部，當細胞外溶液出現冰晶時，進入細胞內部使細胞內溶液濃度升高，細胞內外滲透壓平衡，避免細胞過分脫水而皺縮同時減少細胞外高濃度電解質的損傷。這類冷凍保護劑主要包括甘油、二甲基亞砜、酰胺類等。非滲透性保護劑難以進入細胞內部，但可以結合細胞外水分子，使細胞外自由水含量降低，減少細胞內外的冰晶的形成，從而減少對細胞的損傷的保護劑主要包括：卵黃、低密度脂蛋白等。

蜜蜂采用逐步降溫法冷凍精子是可以采用甘油、二甲亞砜、卵黃等滲透性保護劑和非滲透性保護劑[9,10]，采用玻璃化冷凍胚胎時多采用乙二醇、丙二醇、二甲基亞砜等滲透性保護劑[11,12]。

3.冷凍降溫步驟

低溫冷凍蜜蜂精子是采用逐步降溫法，降溫程序很關鍵。首先混合冷凍保護劑的精液在4℃環境中平衡數小時，根據本團隊研究結果，采用2 ～5℃/min速率下降從4℃降到40℃，最后把混合冷凍保護劑的精液直接投入到液氮中。

低溫冷凍蜜蜂胚胎是采用玻璃化冷凍法，有一步法和兩步法。一步降溫法即將用冷凍保護劑處理好的蜜蜂胚胎直接投入液氮中；兩步法即先在液氮蒸汽中停留幾秒至幾分鐘，再投入液氮中保存。

三、小結

低溫冷凍保存技術對于科學研究和實際應用的意義重大。它可以節約大量的人力、物力和財力，實現大批量生物活性材料的保存。逐步降溫法冷凍是精子冷凍的首先方法，冷凍玻璃化冷凍是胚胎冷凍的首選方法。目前針對蜜蜂精液的逐步降溫冷凍法研究較多，技術相對成熟，針對玻璃化冷凍蜜蜂胚胎研究較少，存在冷凍后胚胎孵化率低等問題，總體來說蜜蜂生殖細胞冷凍保存技術發展迄今幾十年，還有很多難關需要攻克[13,14]，蜜蜂生殖細胞低溫冷凍保存還有很長的路要走。