出血性休克動物選擇與并發其它疾病模型的研究進展

劉洪剛卓美娟聶洪鑫孟 輝*

(1.遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院胸心外科,廣東 珠海 519100;2.遵義醫科大學第五附屬(珠海)醫院口腔頜面外科,廣東 珠海 519100;3.大連醫科大學附屬第二醫院急診科,遼寧 大連 116000)

休克是由于各種原因引起的機體有效循環血量減少、組織灌注不足而導致的細胞缺氧和功能受損的臨床綜合征,主要包括出血性休克(hemorrhagic shock,HS)、感染性休克、心源性休克、神經源性休克和過敏性休克[1]。出血性休克是臨床常見的死亡原因,當機體內失血量超過全身總血量的20%時,即可出現一系列由于血容量灌注不足所致的臨床表現。據報道,全世界每年約有190萬人死于HS,其中約150萬人死于嚴重的機體創傷[2]。如今,有關HS的發病原因、誘因和機制及動物模型的構建已基本明確,但有關HS合并或并發其它疾病如HS瀕死期循環死亡(donation after circulation,DCD)、HS心臟驟停的動物模型還有待于進一步研究。本文就出血性休克模型不同動物的選擇與應用與其合并或并發其它疾病動物模型的研究現狀綜述如下。

1 出血性休克造模方法

出血性休克造模方法大致有定容性、定壓性、非控制性3種類型[3]。定容性出血性休克模型是在麻醉狀態、規定時間內控制實驗動物血容量進行建模,通過該模型可進一步研究動物的血流動力學,其不足之處在于不能控制低血壓程度;定壓性出血性休克模型是在麻醉狀態下進行放血、將血壓控制在預定的范圍內維持一段時間,通過監測血壓來準確地控制低血壓的程度和持續時間;非控制性出血性休克模型是由標準化血管損傷(肝脾擠壓/撕裂、動脈損傷)引起的出血,這種出血性休克模型更貼近創傷后臨床患者的表現。與定容性模型相比,基于實驗標準化和可重復性的特點,定壓性方法是更可靠。Sondeen等[4]研究表明,非控制性出血性休克模型在一定程度上可以彌補控制性出血性休克在血容量喪失和血壓變化方面上的不足。

2 不同動物出血性休克模型的選擇及應用與其合并或并發其他疾病

2.1 小鼠出血性休克模型的選擇及應用與其合并腸道損傷

按近交系實驗小鼠分為BALB/c小鼠、C57BL小鼠、C3H小鼠和615小鼠。因小鼠與人類基因具有高度相似性、較高性價比,小鼠是出血性休克模型的首選實驗動物。Takao等[5]研究發現小鼠的炎癥基因表達模式與人類炎癥基因表達模式非常相似,說明小鼠用作制備人類疾病的動物模型是有實驗優越性。Oyama等[6]通過實驗將小鼠分別暴露于標準室內光和強光后,然后對小鼠進行麻醉、氣管插管和機械通氣,經頸動脈插管進行血壓監測和抽血,使平均動脈壓(mean arterial pressure,MAP)在15 min內降至30～35 mmHg,達到出血性休克的血壓標準;通過進一步分析支氣管肺泡灌洗液的白蛋白和炎癥因子指標,結果顯示肺泡灌洗液的白蛋白、IL-6和IL-8在強光實驗中的表達水平顯著降低,由此得出強光可能在小鼠出血性休克期降低對肺組織的進一步損傷。Gr?ger等[7]選擇C57BL小鼠構建定壓性出血性休克模型(MAP 35 mmHg,60 min),研究3-巰基丙酮酸硫轉移酶(3-MST)的基因突變對創傷性出血性休克小鼠在休克恢復期肺和腎損傷的影響,結果顯示3-MST缺乏對創傷出血性休克小鼠的血流動力學和新陳代謝方面無影響。Dyer等[8]通過小鼠肝撕裂傷的方法建立了一種可靠、規范的非控制性出血性休克模型,通過向肝撕裂實驗小鼠靜脈注射合成血小板,發現此方法可以改善出血性休克小鼠的血流動力學,并且損傷后出現低血壓的時間明顯延長。嚴重多發性腸道損傷常伴有出血性休克,通過HS合并腸道損傷動物模型的建立,探索控制動物模型腸道損傷的途徑。Kao等[9]通過建立HS合并腸道損傷小鼠模型,研究了C-肽可通過減少TNF-α、單核細胞趨化蛋白-1和巨噬細胞趨化蛋白-1來降低小鼠的炎癥反應,并進一步提高了存活率。因此,使用小鼠來建立HS合并腸道損傷的優勢在于有身體較小易操作、小鼠成本較低以及小鼠易于護理等諸多優勢。當然,小鼠也存在血容量較少、插管困難等劣勢,因而小鼠并不適用于血流動力學方面模型的研究。

2.2 大鼠出血性休克模型的選擇及應用與其合并肺損傷

實驗大鼠常用的品系有SD、Wistar、SHR和F344大鼠等4種。SD大鼠是最常用品系,用于模擬HS、肺損傷、多發性創傷、腦震蕩、長骨骨折和鈍性胸部創傷,其次是Wistar以及其他品系大鼠[10]。Yadav等[11]通過抽取約50%的SD大鼠循環血液來誘導出血性休克建立了定容性出血性休克大鼠模型,證實了聯苯二氟銅(EF24)在出血性休克期間可以減輕由于創傷出血引起的炎癥反應。Chu等[12]等利用SD大鼠定壓性出血性休克模型(MAP 40 mmHg,60 min),研究發現早期靜脈注射氨甲環酸可改善中性粒細胞在創傷出血性休克期間引起的腸道屏障損傷。Lee等[13]采用大鼠80%截尾法建立非控制性出血性休克模型,研究得出在治療出血性休克復蘇期間使用脂質體加壓素的大鼠比使用加壓素的大鼠有更好的結果。由于大鼠的血容量比小鼠多,因而大鼠出血性休克模型的建立比小鼠相對更容易。此外,同小鼠一樣,大鼠對出血性休克的部分免疫反應可能與人類相似,大鼠最實用的出血性模型也是固定壓力出血。不過,大鼠的順從性較差、血管壁脆、手術操作難度較高從而影響建模的成功率。目前關于建立HS合并大鼠肺損傷模型的方法主要是通過模擬肺部的撞擊傷、墜落傷、擠壓傷等。Ming等[14]在研究HS合并大鼠肺損傷(撞擊傷致肺損傷模型)時發現,通過輸注右美托咪定可以減輕肺水腫和炎癥反應,證實右美托咪定對急性肺損傷有保護作用。Teng等[15]通過建立大鼠HS合并肺損傷模型,研究了靜脈注射氨甲環酸后對支氣管肺泡灌洗液和血清中炎癥因子(IL-6、TNF-α)的影響,證明了靜脈注射氨甲環酸可以減輕大鼠機體內肺部炎癥反應。

2.3 兔出血性休克模型的選擇及應用與其合并脾損傷

新西蘭大白兔、日本大耳白兔和中國白兔是實驗兔主要的3種類型。兔是第一個應用于免疫學研究模型的動物,其優勢在于它的體型介于嚙齒類動物和更大、更昂貴的動物模型之間[16]。同時,因兔的體型可以隨時采集血液、更容易獲取許多細胞和組織。此外,兔的壽命比嚙齒類動物長,而且兔的免疫系統基因與嚙齒類動物相比更接近于人類免疫系統的基因[17]。Luo等[18]選用新西蘭大白兔建立定壓性出血性休克模型(MAP 45～50 mmHg,3 min),研究激光多普勒成像在出血性休克期間對兔耳微循環的應用,揭示了激光多普勒成像是一種無創性、非接觸性的微循環評價方法,可以為HS的診斷和治療提供有益的幫助。Komori等[19]通過控制日本白化兔的出血量,按照20 mL/min(循環血量的10%～13%),每隔3 min放血4次,總出血量為80 mL,成功制備了定容性出血性休克模型,研究羥乙基淀粉在出血性休克期間對實驗兔微循環、中心靜脈血氧飽和度和中心靜脈-動脈二氧化碳的影響,并闡明了羥乙基淀粉對比晶體液在HS期間對機體復蘇的優缺點。Hagisawa等[20]通過制備新西蘭大白兔嚴重出血性休克模型(MAP (20±2)mmHg,10 min),研究發現通過骨骼內輸注血紅蛋白要比輸注膠體、晶體液、全血或紅細胞懸液輸注在治療嚴重出血性休克復蘇時效果顯著。脾破裂是臨床上較常見的外科急癥,占腹腔臟器損傷中的45%左右,由于脾組織脆弱,血運豐富,稍受外力就可破裂。一旦破裂將出現大出血的癥狀,導致患者發生出血性休克。Zhang等[21]通過新西蘭大白兔脾損傷方法建立非控制性出血性休克模型,研究發現使用新型液體組合(高滲鹽水溶液和乳酸林格液+羥乙基淀粉,比例為2∶1)的方式進行液體復蘇會減少非控制性模型的失血量,同時在低血壓時能夠更好地穩定血流動力學。現如今,兔作為常用動物模型已經越來越多地被應用到人類疾病模型構建,同時兔具有與人類相似的心臟電生理學,可以更好地作為出血性休克模型。與其它大型動物模型相比,兔作為出血性休克模型具有操作方便、成本相對較低、妊娠期較短、后代數量多、大小相對合適等優點[22]。

2.4 犬出血性休克模型的選擇及應用與其合并多發損傷

比格犬、四系雜交犬、紐芬蘭犬、墨西哥無毛犬是實驗犬的4種分型。犬在休克血流動力學的反應方面與人類不經相同,進行犬的出血性休克模型前要提前將犬的脾切除,目的是為了消除自體回血的代償性應激作用,但這可能會改變機體對損傷和休克的免疫反應。近年來,很多學者都在使用Wiggers創立的定壓性出血性休克模型[23],并不斷地進行改良。Pavlisko等[24]通過建立比格犬定壓性出血性休克模型(MAP 55 mmHg,5 min),研究超聲引導下進行實驗犬股動脈插管術,成功率達80%,證明超聲引導下行股動脈插管在急性比格犬出血性休克模型中的可行性。Ke等[25]也建立比格犬定壓性出血性休克模型(MAP 40 mmHg,20 min),驗證通過硅管重新連接比格犬被橫斷的小腸是一種可行的控制損傷方法。Davis等[26]同樣采用犬定壓性出血性休克模型(MAP 40 mmHg,60 min)研究白藜蘆醇對腎的影響,結果發現白藜蘆醇可能會影響出血性休克期間血凝塊強度和凝血酶生成。現如今,交通、自然災害、建設工地等因素引起的HS多發傷發生率越來越多,如何快速現場一線救護、研究無電化救治裝置?為解決這個問題就需要建立HS多發傷動物模型來初步驗證。單一因素指標制作的動物模型不可能全面準確的反應自然災害、恐怖襲擊和非常規戰爭發生出血性休克的具體情況。孟輝等[27]在國內首次用比格犬構建微創血氣胸、失血休克模型與多根多段肋骨骨折、創傷性血胸、張力性氣胸、失血性休克兩種模型,結果顯示本法制作的大動物胸部多發傷失血性休克模型成功率高、可重復性強。由于該模型與臨床十分貼近,因此更加符合臨床創傷患者的進一步研究。犬作為出血性休克合并多發傷模型的優勢在于遺傳性能穩定、品種固定且優良、一般無遺傳性神經疾患、對環境的適應力和抗病力較強,現已廣泛應用于人類疾病模型。

2.5 豬出血性休克模型的選擇及應用與其合并腦損傷

實驗豬有哥根廷小型豬、明尼蘇達-霍麥爾小型豬、皮特曼一摩爾小型豬、西藏小型豬、廣西巴馬小型豬、約克夏豬共6種。豬既是作為理想的出血性動物休克模型又是器官移植和人類疾病研究領域重要的動物模型。長期以來,豬一直用于外科手術模型,其原因在于它們體型適中、有與人類相似的心血管解剖學和生理學[28]。Morris等[29]建立約克夏豬定壓出血性休克模型(MAP (35±5)mmHg,1 h),研究休克期肺中性粒細胞浸潤可作為急性肺損傷的早期標志物,通過豬出血性休克模型的可重復性研究發現,其與人類HS的生理變化一致。Wu等[30]構建北京長白豬的定壓出血性休克模型(MAP (40±3)mmHg,60 min),研究參附注射液與生理鹽水分別在HS后對大腦皮層組織IL-6、TNF-α等炎癥因子的影響,證明參附注射液能改善出血性休克后腦微循環、減少腦損傷,還可以改善心臟驟停復蘇后的腸系膜微血管血流變化。同年,Liang等[31]使用相同豬定壓出血性休克模型(MAP 40 mmHg,60 min)研究發現,參附注射液對出血性休克豬的腸道上皮細胞具有明顯的保護作用。Yanala等[32]通過建立豬脾切除和肝損傷的方法建立非控制出血性休克模型進行研究發現,使用緩慢的輸液速度進行液體復蘇時可以減少出血性休克后的失血量。創傷性腦損傷是急癥中心常見的損傷相關性疾病,外傷嚴重時由于無法及時、有效地止血處置常合并出血性休克。其原發性損傷不可逆轉,繼發性損傷導致的神經細胞死亡是創傷性腦損傷的病理生理機制和潛在的治療靶點,如何減少神經元死亡是治其繼發性損傷的關鍵策略之一。目前研究表明復蘇時的精準液體治療,保證腦組織灌注,維持腦氧供需平衡,可顯著減少繼發性腦損傷。但是,選用何種動物是建立HS合并創傷性腦損傷動物模型的研究重點。Dekker等[33]使用豬制備沖擊傷模型探尋HS合并創傷性腦損傷時丙戊酸(一種組蛋白去乙酰化酶抑制劑)對繼發性腦損傷的影響。Mayer等[34]同樣選用豬建立HS合并創傷性腦損傷模型,該研究發現通過靜脈輸注17α-乙炔雌二醇-3-硫酸酯(一種雌性激素)比選用0.45%氯化鈉溶液在心血管恢復和保護神經方面效果更顯著。豬作為出血性休克合并腦損傷模型的優勢不僅在于心血管和血流動力學方面與人類有較高的相似度,而且在皮膚傷口愈合方面和新陳代謝方面亦與人類十分相似,在免疫方面的應用更越來越廣泛[35-36]。

2.6 靈長類動物出血性休克模型的選擇及應用與其合并腎損傷

靈長類動物作為實驗動物模型常用的品種主要有恒河猴、熊猴、短尾猴、食蟹猴、平頂猴。在遺傳學方面,靈長類動物是最接近人類的動物;在壓力和低血容量性休克方面具有與人類相似的生理反應,并在藥物代謝方面與人類高度一致,所以靈長類動物作為人類理想的動物模型具有先天優勢[37]。Sheppard等[38]通過建立恒河猴定壓性出血性休克模型(MAP 20～24 mmHg,30 min),研究恒河猴在出血性休克期間生理、代謝、免疫和凝血的反應,以及合并肌肉骨骼損傷和軟組織損傷時的反應。證明恒河猴是一種更容易實現人類創傷的動物模型,以便用于未來臨床治療測試和評估。Crossland等[39]通過建立靈長類動物左半肝切除術的方法建立非控制性出血性休克模型,并證明了評估休克狀態下嚴重程度的首要指標是組織氧飽和度(StO2)、潮氣末二氧化碳(ETCO2)和循環乳酸。急性腎損傷同樣是是出血性休克患者的最主要并發癥之一,患者在急性腎損傷后可出現不可逆性腎功能下降以及慢性腎臟疾病,是導致出血性休克患者死亡的重要原因之一。Halbgebauer等[40]通過建立雄性食蟹猴定壓性出血性休克模型(MAP 30 mmHg,60 min),研究Thirty-Eight-Negative Kinase 1(TNK1)在出血性休克期間的表達對腎損傷的影響,說明體內補體C3通過中和TNK1來抑制機體內炎性介質的釋放和炎癥反應。雖然靈長類動物是在遺傳學、生理學和行為方面是與人類最接近的動物模型,但其主要缺點是創建急性和慢性損傷模型時成本和倫理問題的復雜性是主要限制因素[41],因此,靈長類動物模型在臨床應用方面相對較少。

3 展望

綜上所述,盡管出血性休克動物模型應用十分廣泛,但在選擇適當的出血性休克動物模型時還應考慮實驗動物的可用性、成本、倫理、與人體解剖學和生理學的相似性等問題。為了研究與血性休克相關的病理生理學和治療措施,通常優先出選擇可控性和可重復性比較好的定壓性和定容性的出血性休克模型。然而,對于非控制性出血性休克模型,特別是與其它創傷疾病相結合時,選擇此模型則更具有臨床意義,不過有關此類模型還有待于進一步研究。