miRNA在膿毒癥治療中研究進展

孫文杰 霍景瑞 賈力 劉英富

(1滄州醫學高等專科學校,河北 滄州 061000；2滄州市納米抗體技術創新中心)

最新膿毒癥國際共識定義為機體對感染的反應失調而導致的危及生命器官功能障礙〔1〕。膿毒癥是一個全球性公共衛生問題，是感染導致死亡的主要原因，據統計在ICU中膿毒癥的死亡率要高達20%～45%〔2〕。膿毒癥的高死亡率與延遲診斷和治療不當有直接關系。膿毒癥的發病機制復雜且尚未完全明確，目前其治療手段以抗感染、液體復蘇、血流動力學支持等為主。免疫治療相關靶點藥物，包括腫瘤壞死因子(TNF)-α拮抗劑、程序性死亡分子(PD)-1、白介素(IL)-7、干擾素(IFN)、巨噬細胞集落刺激因子(M-CSF)、高遷移率族蛋白(HMG)B1等在實驗階段取得了一定進展，但是臨床療效還未明確〔3〕。微小RNA(miRNA)在細胞和體液中廣泛存在，廣泛調控免疫細胞的行為及免疫、炎癥反應、臟器損傷等多種生理病理過程〔4,5〕，在膿毒癥的各個階段發揮調控作用，有可能成為新型膿毒癥治療靶點，具有重要的研究意義。

1 miRNA的特征及疾病中的應用

miRNAs是一類21～25個核苷酸組成的小分子非編碼RNA，在細胞質中合成，以核糖體蛋白復合物、脂質囊泡、外泌體等形式釋放到細胞外，不被核糖核酸酶(RNase)消化，在一些體液中穩定存在〔6〕。miRNAs通過囊泡轉運或蛋白載體機制被細胞輸出或輸入，介導組織間的旁分泌和內分泌的通訊，從而調節遠端細胞功能。大部分miRNAs靶向mRNA，抑制mRNA轉錄后翻譯或降解mRNA使基因沉默〔7〕，也有少部分誘導轉錄或上調蛋白的表達〔8〕。

目前在人類基因組中已發現2 000～3 000個miRNAs，廣泛調控細胞的分化、增殖、凋亡途徑，參與調節代謝、造血分化、免疫及炎癥反應等多種生理過程。miRNAs臨床應用需要搭載有效的載體，保護其免受RNase降解并遞送至感染部位。生物體內miRNAs的理想載體是外泌體，干細胞來源的外泌體有望代替干細胞移植療法用于疾病治療〔9〕，而miRNAs的人工載體包括無機材料載體、脂質納米載體等也取得了一定進展〔10〕。目前miRNAs的研究領域逐漸擴大，涉及腫瘤、帕金森病、阿爾茨海默病、肥胖、糖尿病、心血管疾病、膿毒癥等多種疾病〔4,5〕，miRNAs具有成為新型藥物靶點的潛力，成為多種疾病研究的熱點。

2 miRNA與膿毒癥的治療

膿毒癥發病機制復雜，除了病原微生物及其毒素的直接損傷作用，感染導致機體炎癥激活狀態和免疫功能紊亂，進而導致器官功能障礙甚至危及生命。目前膿毒癥的治療手段和治療藥物都收效有限〔2,3〕。膿毒癥中多種miRNAs異常表達，通過介導細胞間信息傳遞和調控基因表達，調控免疫細胞等增殖、分化、凋亡過程，并調控抗體產生、炎癥介質釋放等過程。miRNAs對膿毒癥過程中通過調控Toll樣受體(TLR)信號傳導通路，調節炎癥因子的產生〔11,12〕。miRNAs可調節膿毒癥中內皮細胞的功能，減輕微血管功能障礙，減輕組織器官損傷〔13,14〕。miRNAs參與膿毒癥的固有免疫和適應性免疫應答〔15〕免疫抑制及抗感染作用。miRNAs在膿毒癥的各個階段發揮調控作用，有潛力成為新型膿毒癥治療靶點。

2.1miRNA與抗炎作用 膿毒癥的主要機制之一是感染激活炎癥反應，經一系列炎癥因子級聯瀑布反應，形成過度炎癥狀態。miR-146a是脂多糖(LPS)誘導的炎癥反應和器官損傷的有效負調節劑。在LPS誘導膿毒癥模型中，miR-146a過表達通過靶向酪氨酸蛋白激酶受體(ErbB)4基因，抑制IL-1受體相關激酶(IRAK)1和TNF-α受體相關因子(TRAF)6的表達，抑制核轉錄因子(NF-κB)的活化，降低TNF-α和IL-1β等促炎因子水平，減少細胞損傷和凋亡，減輕LPS誘導炎癥反應和心肌功能障礙〔16〕。LPS誘導巨噬細胞中，miR-146a水平升高，通過靶向跨膜受體Noth蛋白(Notch)1基因，降低IL-1β、IL-6和趨化因子配體(CCL)-2水平，抑制NF-κB激活，減輕炎癥反應及臟器損傷〔17〕。

miR-23b在膿毒癥中也具有抗炎和保護臟器的作用。在膿毒癥患者外周血單核細胞和LPS誘導的單核細胞中miR-23b表達下調，miR-23b通過靶向金屬蛋白酶(ADAM)10基因，抑制炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6產生和細胞凋亡，減輕炎癥反應〔18〕。Cao等〔19〕發現膿毒癥性心肌病患者早期miR-23b上調，miR-23b過表達通過靶向髓樣分化因子初次應答基因(MyD)88基因調控TRAF6和NF-κB抑制物激酶(Iκκ)β，抑制NF-κB活化，減少心肌細胞凋亡和炎性因子分泌，減輕炎癥反應，提高生存率，是在膿毒癥性心肌病的潛在早期療法。

miR-223、miR-718、miR-181a通過多靶標調節炎癥反應。Wang等〔20〕發現，在盲腸結扎穿刺(CLP)膿毒癥模型中，miR-223-3p和miR-223-5p顯著下調，miR-223通過負向調控信號傳導與轉錄活化因子(STAT)-3和IL-6，抑制炎癥反應，保護膿毒癥性心肌損傷。miR-718通過靶向腫瘤抑制性磷酸酶與張力蛋白同源性基因(PTEN)基因，調節磷脂酰肌醇激酶/絲氨酸激酶(PI3K/Akt)信號，促進Akt磷酸化，抑制促炎因子IRAK1和NF-κB的產生，而且磷酸化的Akt誘導miR-let-7e表達，下調TLR并弱化促炎信號，減輕炎癥反應〔11〕。miR-181a通過直接抑制TLR4的表達、抑制NF-κB活化和活性氧的積累，減少炎癥因子的產生，發揮抗炎作用〔12〕。

此外，還有很多miRNA在膿毒癥中具有調控炎癥反應的作用。miR-15a/16抑制LPS誘導膿毒癥炎癥途徑的關鍵分子TLR4和IRAK-1，在新生兒膿毒癥的炎癥反應調控中起重要作用〔21〕。Xu等〔22〕研究發現膿毒癥患者血清中的miR-19b-3p水平比健康對照組顯著降低，而存活組的膿毒癥患者與非存活組相比miR-19b-3p水平顯著較高。miR-19b-3p的過表達可以降低IL-6和TNF-α水平，減輕LPS誘導的膿毒癥炎癥反應，可能是膿毒癥患者診斷和預后的潛在靶標。

2.2miRNA與增強免疫功能 在膿毒癥進程中，免疫抑制狀態長時間持續存在，固有免疫失衡，樹突細胞(DC)和巨噬細胞的抗原提呈能力降低，T細胞和免疫抑制細胞因子在損傷部位大量聚集，患者極易受到繼發性感染〔23〕，與膿毒癥后期的高死亡率直接相關。因此，增強免疫功能對膿毒癥治療尤為重要。

miR-155是調節免疫抑制的潛在靶點。精氨酸酶(Arg)2是DC中主要的酶，miR-155靶向Arg2 mRNA抑制其表達，通過控制細胞外精氨酸的利用來調控T細胞活化〔24〕。CD39+T細胞具有免疫抑制的作用。miR-155可以誘導CD39+T細胞增加，增強免疫抑制，而抑制miR-155可以減少CD39+T細胞，改善免疫抑制狀態〔15〕。

髓樣抑制細胞(MDSC)可以促進免疫抑制狀態。在膿毒癥中miR-21和miR-181b通過誘導髓系祖細胞成熟分化，增加MDSC數量，抑制miR-21和miR-181b可減少MDSC，改善免疫抑制狀態〔25〕。還有研究發現，miR-375通過阻斷酪氨酸激酶(JAK)2-STAT3途徑，下調miR-21水平，調控MDSC數量，削弱免疫抑制，參與晚期膿毒癥的調節〔26〕。

miRNAs還具有調控T細胞功能的作用。在膿毒癥中，miR-31調節Th1/Th2平衡狀態，miR-31表達下調促進CD4+T細胞向Th2表型轉化，從而促進高炎癥狀態到免疫抑制狀態的轉變〔27〕。miR-31在敗血性CD4+T細胞中的作用，有助于免疫制劑機制的研究和開發miRNA對膿毒癥診療的新方法。

2.3miRNA與器官保護作用 膿毒癥通常會導致器官功能受損，多器官功能障礙綜合征是主要致死原因，而器官保護是治療膿毒癥的一個重要原因。

短暫性缺血引起的缺血預處理是器官保護的先天機制。腎臟缺血預處理可誘導miR-21上調，miR-21在外泌體和遠端器官中表達增加，減少對應器官中的細胞凋亡和炎癥因子的產生〔28〕。外泌體遞送miR-21在膿毒癥急性腎損傷中具有抗炎、抗細胞凋亡、保護臟器的作用〔29〕，是其有效的治療策略。

膿毒癥誘導心肌損傷的潛在機制包括心肌收縮力受損、過度炎癥、氧化應激、心肌細胞凋亡等。miR-30a-3p過表達通過PTEN/PI3K/AKT信號途徑減少膿毒癥誘導心肌細胞和肺組織細胞的凋亡，具有保護膿毒癥性心肌病和肺損傷的作用〔30,31〕。miR-18a-5p過表達通過下調Notch2表達，抑制內皮-間充質轉化和心臟纖維化〔13〕。內皮祖細胞來源的外泌體通過體外遞送miR-126-3p和miR-126-5p抑制內皮細胞中HMGB1及血管細胞黏附分子(VCAM)-1水平，減輕膿毒癥性器官損傷，預防微血管功能障礙〔14〕。Zheng等〔32〕研究發現在膿毒癥患者血清中miR-135a上調，通過p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)/NF-κB途徑加重了膿毒癥誘導的心肌炎癥反應和心臟功能障礙，而miR-135a抑制劑通過調節p38 MAPK/NF-κB途徑，能夠改善膿毒癥誘導的心肌性疾病。在CLP膿毒癥模型中miR-214表達上調、miR-214過表達、減輕炎癥反應和心肌細胞凋亡，對膿毒癥誘發心肌損傷具有保護作用〔33〕。

2.4miRNA與抗感染作用 miRNAs可以調節宿主對抗微生物感染的防御能力，對繼發性膿毒癥患者抗感染的防治有重要意義。

miRNAs具有抗細菌作用。結核分枝桿菌感染巨噬細胞誘導miR-125a-3p上調，靶向巨噬相關基因(UVRAG)基因，抑制吞噬體的成熟和自噬，而抑制miR-125a的表達可增強巨噬細胞的吞噬功能和殺菌活性〔34〕。沙門菌通過上調腸道上皮miR-128的表達，抑制M-CSF及其介導的巨噬細胞募集，促進細菌存活，而抑制miR-128可增加巨噬細胞募集，抑制沙門氏菌感染〔35〕。

miRNAs具有抗真菌作用。miR-132-5p和miR-212-5p在煙曲霉和白色念珠菌感染期間調節靶基因FK506結合蛋白(FKBP)1B基因、Kruppel樣因子(KLF)4基因、多殺菌素合成基因(SPN)的表達，調控自然殺傷細胞(NK)和DC等先天免疫細胞抗真菌的免疫作用〔36〕。miR-204和miR-211通過負調控血紅素加氧酶(Hmx)1表達，介導了機體免疫抑制和念珠菌感染型膿毒癥引起的腎臟損傷，而miR-204/miR-211模擬物可以顯著下調Hmx1，改善念珠菌引起的腎臟損傷〔37〕。

miRNAs還具有抗病毒作用。腸道病毒(EV)-71通過誘導宿主細胞中miRNA-146a上調，抑制IFN產生，而抑制miR-146a可上調IRAK1和TRAF6的表達，增加IFNβ的產生，抑制病毒繁殖并提高感染小鼠的存活率，用于防治EV感染〔38〕。寡核苷酸抑制劑(RG)-101靶向miR-122，通過調控NK細胞，調控IFN水平，顯著降低丙型肝炎病毒載量，發揮抗病毒作用〔39〕。miR-134通過調控RAS相關核蛋白(RAN)調節脊髓灰質炎病毒、EV71等病毒的復制〔40〕，為抗病毒感染提供了一種新方法。

2.5miRNA的載體 基于miRNAs的療法可能是抗過度炎癥反應、增強免疫應答、抗微生物治療、保護臟器功能的有效手段，miRNAs有潛力成為治療膿毒癥的新型靶點，但其臨床使用仍存在一些問題，包括核酸的陰離子電荷、親水性及給藥方法和藥物設計需要保護miRNA模擬物/拮抗劑免受循環RNase降解、遞送系統須確保將miRNAs有效遞送至感染部位等。天然存在的miRNAs可以通過液囊或與其相連的蛋白質來保護其免受RNase降解，但治療性引入的miRNAs需要搭載有效的載體，才能順利進入細胞并發揮治療效果。

在生物體，外泌體是miRNAs的理想載體。外泌體是一類由細胞產生的30～100 nm的胞外囊泡，具有穩定、兩親特性、免疫原性低、跨生物屏障等特點，可以作為miRNAs的輸送載體轉運細胞間的miRNAs等發揮細胞間通訊作用〔41〕。外泌體可以用于膿毒癥及其相關臟器損傷的治療，在炎癥反應、免疫抑制、抗原呈遞、抗體產生及血管修復等過程中起重要的調節作用〔9，41〕。而且，從間充質干細胞(MSC)純化的外泌體可起到與MSC相似的治療效果，有望代替MSC干細胞移植療法治療膿毒癥〔9〕。Zhang等〔42〕通過研究證明，人臍帶間充質干細胞來源的外泌體通過上調miR-146b水平降低IRAK1表達，導致NF-κB活性受到抑制，并最終減輕膿毒癥性腎損傷并改善膿毒癥小鼠的存活率，可能成為治療膿毒癥相關腎損傷的新型治療藥物。Wang等〔43〕研究發現野生型間充質干細胞含有miR-223的外泌體通過miR-223向受體細胞的轉移而減輕膿毒癥觸發的心肌抑制，下調信號素(Sema)3A和Stat3的表達，從而減少炎癥反應和細胞死亡，可對膿毒癥小鼠提供心臟保護作用。

miRNAs的人工合成載體也取得一定進展。據研究，脫乙酰化的聚-N-乙?；咸前?DEAC-pGlcNAc)納米載體具有良好的生物相容性和非特異性的抗菌性，可以作為miRNAs 載體，在膿毒癥小鼠模型中有效地遞送miRNA-126-5p免受RNase的破壞，并通過熒光標記成功將其傳遞到細胞核中，顯著提高膿毒癥小鼠的存活率〔44〕。此外，miRNAs的病毒載體、無機材料載體、脂質納米載體、樹狀聚合物的載體、細胞衍生膜囊泡、3D支架載體在多種疾病研究中都取得了一定進展〔10〕，為miRNAs作為新的膿毒癥治療靶點和治療途徑奠定了基礎。

綜上，膿毒癥是ICU患者高死亡率的主要原因，大量研究證實miRNAs在膿毒癥的抗炎、抗感染、增強免疫功能及臟器保護方面具有重要的調節作用，但其潛在機制還不明確。研究結果之間存在差異，可能是由于研究多在ICU或動物實驗中進行，研究設計和實驗樣本等存在差異。miRNAs種類繁多，廣泛參與細胞活動，涉及很多信號通路，同一個miRNA可能在感染的不同階段調節不同的靶標，或同時靶向多靶標產生不同的功能，因此miRNAs的應用中可能產生脫靶效應，限制其療效和安全性，需要探索其確切機制提高研究的可重復性?；疾r長的差異也會在數據中產生干擾，miRNAs水平的縱向研究將提供膿毒癥進程中miRNAs表達譜的變化，還需要實驗研究區分出最有效的干預靶點，并探討如何隨著疾病進展交替調節miRNAs治療膿毒癥。隨著研究的深入，miRNAs可能會成為新型的膿毒癥治療靶標，通過調控炎癥反應和免疫功能等，改善患者預后、降低死亡率、改變膿毒癥的治療策略。