早熟陸地棉種萌發中種胚保護性酶活性對鹽脅迫的響應

張紅霞，雍曉宇，何 飛，夏 軍，李慧琴，王潭剛

(1.石河子大學農學院/新疆生產建設兵團綠洲生態農業重點實驗室，新疆石河子 832003；2.新疆生產建設兵團第三師農業科學研究所，新疆圖木舒克 843901)

0 引 言

【研究意義】土壤鹽堿化是阻礙作物產量增長的主要因素之一，當土壤中鹽含量達到0.2%～0.5%時種子出苗困難,大于0.65%時發芽率顯著降低[1,2]。棉花具有良好的耐鹽性和抗氧化性[3]。新疆灌區鹽堿土覆蓋面積848×104hm2[4,5]，且因環境、溫度以及地理位置的影響，灌區土壤鹽漬化面積有所增加[6]。研究棉花耐鹽機理，對于新疆早熟陸地棉減輕鹽脅迫有實際意義。【前人研究進展】棉花種子的耐鹽水平與大麥相當[7]，多分布于干旱鹽堿地區，雖然棉花具有一定的耐鹽性，但鹽分過高也會對其造成傷害[8]，周桃華等[9]認為種子傷害程度與鹽濃度有關，種子萌發及幼苗生長耐鹽最大適宜濃度為5%，低鹽濃度可以促進種子萌發；高鹽分則抑制種子萌發。1%的NaCl溶液處理下，遼2230抗鹽型品種種子在處理過程中正常發芽，植株的相對含水量較高；而敏感品種則不能正常發芽，即使發芽，幼苗也多出現弱苗、死苗現象，植株的相對含水量低，相對鹽脅迫傷害率高[10]。水分是種子萌發的關鍵，鹽濃度的升高導致種子吸水困難，影響種子萌發速率[11]。種子發芽是基于胚的生長，胚的生長則是種子內部所有生理生化系統協調作用的結果[12]。在NaCl溶液處理下，植物體內保護性酶活性與植物抗氧化脅迫能力呈正相關，在鹽分脅迫下，鹽生植物與非鹽生植物相比，SOD，POD，CAT的活性更高，能更有效地清除活性氧，阻抑膜脂過氧化[13]。【本研究切入點】鹽脅迫對棉花種子的萌發會造成不良影響，且不同棉花品種對于鹽脅迫的抗逆性也各不相同。但是，大多數研究鹽脅迫對棉種萌發的影響僅僅局限于種子含水量和相對鹽脅迫傷害率，對于種子內部的生理機制的變化，尚缺乏系統研究。需研究不同濃度鹽脅迫對早熟棉花種子萌發特性及關鍵酶活性的影響。【擬解決的關鍵問題】以2個新陸早棉花品種為試驗材料，設置不同濃度的鹽脅迫處理，測定種子發芽率、發芽指數以及種子萌發過程中種子活力、種胚酶活性的變化，分析不同程度鹽脅迫影響棉種萌發的生理機制，為提高棉花種子耐鹽能力及抗鹽堿育種提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材 料

選擇新陸早45號和新陸早65號為供試品種。選取籽粒大小一致，成熟飽滿的棉花種子，用10%雙氧水消毒后無菌水沖洗5～6次后晾干備用；取高溫消毒后的培養皿用于試驗。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

共設5個處理：0(對照)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%NaCl溶液，設置4次重復，每個重復放置10粒種子，第一階段：將新陸早45號、新陸早65號種子整齊擺鋪在有2層濾紙的培養皿(φ=15 cm)中，每皿擺放10粒種子，加0(對照)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%NaCl溶液至飽和狀態，測定不同濃度處理下2品種相對含水量變化，每2 h測定1次。試驗前，將每個處理每個重復種子用天平測得重量并記錄；第二階段：將新陸早45號，新陸早65號置于NaCl濃度為0(對照)、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%蛭石中(65 g蛭石與90 mL溶液充分混合)，在恒溫培養箱內培養，設置白天16 h，28℃；夜間8 h，18℃。測定發芽勢(3 d)，發芽率(7 d)。

1.2.2 測定指標

1.2.2.1 棉種含水量

處理后每隔2 h用萬分之一天平分別測定種子重量，測定至發芽并統計，每處理重復4次。

1.2.2.2 發芽率、發芽勢、發芽指數、鹽害指數和鹽害級別

處理3 d、7 d后分別計算發芽種子粒數，每個處理設置4次重復。

發芽率(%)=處理發芽率/對照發芽率×100%；

發芽勢(%)=(規定時間內發芽種子粒數/供試種子粒數)×100%；

發芽指數(GI)=∑(Gt/Dt).

式中，Gt為在不同時間的發芽數，Dt為發芽天數。

鹽害指數(%)=(對照發芽率 - 處理發芽率)/對照發芽率×100%。

當發芽率大于對照時為無鹽害，記為0；鹽害級別判定標準為：1 級(鹽害指數≤20%)；2 級(20%<鹽害指數≤40%)；3級(40%<鹽害指數≤60%)；4 級(60%<鹽害指數≤80%)；5 級(鹽害指數>80%)。

1.2.2.3 過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD) 、丙二醛(MDA)含量

采用紫外吸收法測定過氧化氫酶(CAT)活性[14]。氮藍四唑法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性[15]，采用硫代巴比妥酸顯色反應法測定丙二醛(MDA)含量[16]。

1.2.2.4 脯氨酸(Pro)、可溶性蛋白質含量

參考李合生的方法測定脯氨酸含量[16]，采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白含量[15]。

1.3 數據處理

采用Excel軟件統計數據；SPSS 19.0軟件分析單因素方差，用Duncan法(α=0.05)檢驗顯著差異性；采用Sigmaplot12.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 NaCl脅迫對棉花種子相對含水量的影響

研究表明，隨NaCl處理時間的延長，0～15 h內棉種相對含水量持續上升，15～60 h逐漸平緩，63 h時相對含水量有上升趨勢。新陸早45號種子的相對含水量在不同NaCl濃度下表現為：0.2%比對照的相對含水量高，0.8%相對含水量最低；新陸早65號的不同濃度處理間無明顯差異。0～15 h新陸早65號比新陸早45號斜率大，吸水速率大，且相對含水量新陸早65號>新陸早45號。圖1

圖1 不同濃度NaCl脅迫下2棉花品種相對含水量變化Fig.1 Relative water content of two cotton varieties under different concentrations of NaCl stress

2.2 NaCl脅迫對棉花種子相對發芽率、發芽勢的影響

研究表明，與對照相比，新陸早45號種子的相對發芽率隨鹽濃度增加逐漸下降，0.2%和0.4%濃度NaCl處理下種子相對發芽率均和對照無顯著差異。當鹽濃度增加至0.6%和0.8%，種子相對發芽率與對照相比下降迅速，分別降低86%和171%，差異顯著；新陸早65號棉種的相對發芽率則隨鹽濃度的增加呈現先升高后降低的趨勢，0.2%、0.4%和0.6%NaCl濃度下，種子相對發芽率均高于對照，其中0.4%NaCl濃度水平時，該處理的相對發芽率較對照增加了28%，鹽溶液對種子萌發的促進效果最明顯，與對照相比，0.8%NaCl濃度處理下的種子相對發芽率受到較高抑制，且相對萌發率降低42%。

隨著NaCl濃度的升高，2個棉花品種的的發芽勢均呈下降趨勢。與對照相比，NaCl脅迫顯著降低了新陸早45號種子的相對發芽勢，0.2%、0.4%、0.6%和0.8%4個鹽濃度條件下，其相對發芽勢分別降低88%、153%、122%和155%，有顯著差異；而對于新陸早65號，0.4%NaCl濃度水平下種子相對發芽勢較對照升高14%，而當NaCl濃度增加至0.6%水平時，種子相對發芽勢受到抑制，與對照相比降低11%，當NaCl濃度繼續升高至0.8%時，種子相對發芽勢大幅下降，降幅達58%。圖2

圖2 不同NaCl脅迫下2棉花品種的相對發芽率、相對發芽勢變化Fig.2 Comparison between the relative germination rate and the relative germination potential of the two cotton varieties under different concentrations of NaCl stress

2.3 NaCl脅迫對棉花種子發芽指數的影響

研究表明，2品種的發芽指數隨NaCl濃度的升高，0.4%后表現出下降的趨勢，NaCl濃度在0.4%之前，新陸早65號發芽指數隨鹽濃度的升高呈先升高后降低，且鹽濃度0.2%、0.4%時分別比對照高出8.7%、40.2%；新陸早45號隨鹽濃度的升高而降低。新陸早65號發芽指數始終高于新陸早45號，在0、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%分別高出135.2%、21.7%、25.9%、88.4%和52.2%。圖3

圖3 不同NaCl脅迫下2棉花品種發芽指數比較Fig.3 Comparison between germination indexes of the two cotton varieties under different concentrations of NaCl stress

2.4 NaCl脅迫下不同棉花品種鹽害指數和鹽害級別變化

研究表明，NaCl濃度與鹽害指數和鹽害級別均呈正相關關系，即NaCl濃度越高，鹽害指數和鹽害級別越高。新陸早45號種子在≤0.6%NaCl濃度處理鹽害指數緩慢增加，0.8%濃度NaCl處理時大幅升高，較0.6%濃度處理增加36%。在0.2%～0.6% NaCl濃度范圍內，新陸早65號種子的萌發均未受到鹽害，即鹽害指數均為0，0.8%濃度處鹽害指數上升至0.3；在0.2%～0.8%NaCl濃度范圍內，不同品種所處鹽害級別表現出顯著差異，新陸早45號的鹽害級別隨鹽濃度的升高，由2級升高至4級，而新陸早65號在≤0.6%NaCl濃度下處于未受鹽害狀態，僅在0.8%濃度下，鹽害等級為2級。2個品種的耐鹽性強弱為新陸早65號>新陸早45號。表1

表1 不同棉花品種鹽害指數和鹽害級別Table 1 Salt damage index and salt harm level of different cotton varieties

2.5 NaCl脅迫對棉花種子脯氨酸(Pro)含量的影響

研究表明，隨NaCl處理時間的延長，2品種棉種內累積的脯氨酸含量均呈現在3～60 h內持續增高且在60 h處達到峰值，其后開始下降，且各處理值均高于對照。隨著NaCl濃度的增加，種子內游離脯氨酸含量顯著升高；品種間，新陸早45號種子在0.4%NaCl濃度處達到最大值，新陸早65號在0.8%NaCl濃度處達到最大值。相同NaCl濃度脅迫的80 h內，新陸早65號游離脯氨酸含量在0.2%、0.4%、0.6%和0.8%NaCl濃度下較新陸早45號分別高0.7%、1%、21%和41%。圖4

2.6 NaCl脅迫對棉花種子可溶性蛋白(SP)含量的影響

研究表明，在NaCl脅迫處理80 h時，種子體內可溶性蛋白含量隨著鹽濃度的增加有增加的趨勢。不同品種在相同鹽脅迫下可溶性蛋白含量不同，新陸早45號變化幅度小，0.2%、0.4%、0.6%、0.8%NaCl濃度下，可溶性蛋白含量與對照間無顯著差異；新陸早65號在0.2%、0.4%、0.6%、0.8% NaCl濃度下均高于對照，且在0.4%濃度處達到最高值，與對照相比增長近14%，新陸早65號的酶活性最高。在相同濃度鹽脅迫下，新陸早65號蛋白含量均高于新陸早45號，在0.2%、0.4%、0.8%NaCl濃度下分別高出10%、12.73%、7.8%，差異顯著。圖5

圖4 不同NaCl脅迫下棉花種子脯氨酸(Pro)含量變化Fig.4 Effects of different concentrations of NaCl stress on proline (Pro) content in cottonseeds

圖5 不同NaCl脅迫下棉花種子可溶性蛋白含量變化(80 h)Fig.5 Effects of different concentrations of NaCl stress on soluble protein content in cottonseeds(80 h)

2.7 NaCl脅迫對棉花種子丙二醛(MDA)含量的影響

研究表明，NaCl脅迫處理80 h處，種子體內丙二醛含量隨著鹽濃度的增加而顯著升高，其中新陸早45號增幅較大，且在0.8%NaCl濃度處與對照相比增長達98%，新陸早65號變化較為穩定且變幅較小，0.8%NaCl濃度處丙二醛含量達到最大增幅，增長近16%。在相同濃度NaCl脅迫下，新陸早45號種子丙二醛含量均高于新陸早65號，且在0.2%、0.4%、0.6%和0.8%NaCl濃度下，新陸早45號較新陸早65號分別高22%、20%、10%和63%，差異顯著。圖6

2.8 NaCl脅迫對棉花種子抗氧化酶活性的影響

2.8.1 對棉花種子超氧化物歧化酶(SOD)活性影響

研究表明，2個品種的棉花種子在處理的80 h內，SOD活性均隨著處理時間的延長呈先緩慢增加后快速降低的趨勢。不同品種棉花種子SOD活性隨著鹽濃度的增加變化趨勢差異較大，與對照相比，新陸早45號種子各處理隨著鹽濃度的增加SOD活性呈顯著降低；新陸早65號種子SOD隨鹽濃度的增加呈倒“V”型變化，在0.4%NaCl濃度處達到最高值，0.2%和0.4%NaCl濃度處理下SOD活性與對照無顯著差異，0.8%NaCl濃度顯著降低了SOD活性。在相同NaCl濃度下，新陸早65號SOD變化較為緩慢且變幅較小，新陸早45號變幅劇烈，處理前60 h在0.2%、0.4%、0.6%和0.8%鹽濃度處理下，新陸早65號的平均SOD活性較新陸早45號分別高出15%、19%、2%和13%，新陸早65號種子在鹽脅迫時，保護性酶系統發揮的作用較強。圖7

圖6 不同NaCl脅迫下棉花種子丙二醛(MDA)含量變化(80 h)Fig.6 Effects of different concentrations of NaCl stress on alpodialdehyde (MDA) content in cottonseeds(80 h)

圖7 不同NaCl脅迫下棉花種子超氧化物歧化酶(SOD)活性變化Fig.7 Effects of different concentrations of NaCl stress on superoxide dismutase (SOD) content in cottonseeds

2.8.2 對棉花種子過氧化氫酶(CAT)活性影響

研究表明，在NaCl脅迫下，CAT活性隨著脅迫處理時間的延長表現出先增加后減小的變化趨勢，因品種差異，新陸早45號在鹽脅迫處理后40 h內持續增加并于40 h內達到最大值，新陸早65號在鹽脅迫處理后60 h內持續增加并于60 h內達到最大值，達到最大值后2品種的CAT活性均開始下降。2品種棉花種子CAT活性隨著鹽濃度的增加變化趨勢一致，均表現為低濃度鹽促進和高濃度鹽抑制，但不同品種其種子CAT活性對脅迫的適應能力不同，新陸早45號在0.2%NaCl及以下濃度表現為促進CAT活性，在0.4%NaCl濃度及以上表現為抑制，而新陸早65號CAT活性則在0.8%NaCl濃度處表現為抑制。相同NaCl濃度脅迫的80 h內，新陸早65號CAT活性在0.2%、0.4%、0.6%和0.8%NaCl濃度下較新陸早45號分別高29%、39%、35%和9%，新陸早65號棉種相較于新陸早45號清除過氧化氫(H2O2)的能力較強。圖8

圖8 不同濃度NaCl脅迫下棉種過氧化氫酶(CAT)活性變化Fig.8 Effects of different concentrations of NaCl stress on catalase (CAT) content in cottonseeds

2.9 NaCl脅迫對棉種萌發生理指標參數變異的影響

研究表明，提取了前2個主成分，其中，新陸早45號的2個主成分總體貢獻率為66.1%，新陸早65號兩主成分累計貢獻率達60.7%，對數據組的總變異擁有較高的解釋。在第1主成分中，新陸早45號的SP、Pro、MDA和新陸早65號的SP、CAT的權重系數均高于0.450 0，脅迫時間對新陸早45號的SP、Pro、MDA和新陸早65號的SP、CAT有著明顯的影響，在第2主成分中，新陸早45號和新陸早65號的SOD、CAT的載荷值較高，SOD、CAT受到鹽脅迫的影響較為明顯。圖9，表2

3 討 論

棉花具有一定的耐鹽堿和耐旱性[17-20]，但鹽分過大也會對其產生嚴重的影響[21-23]。試驗結果表明，鹽脅迫會影響種子的保護性酶活性從而影響到種子的萌發，并且濃度越高，脅迫表現越明顯。

圖9 鹽脅迫下棉花發芽參數的主成分變異Fig.9 Principal component analysis of NaCl stress and effects on germination parameters in cotton

表2 參數矩陣Table 2 Parameter matrix analysis

張國偉等[21]報道可將發芽率、發芽勢、發芽指數、活力指數等作為棉花萌發期耐鹽鑒定的指標。試驗結果表明，隨著鹽濃度的增加，棉花種子的發芽率、發芽勢、發芽指數呈先升高后下降趨勢，鹽害指數呈上升趨勢，且不同品種間也有差異。低鹽濃度對種子發芽率沒有影響，但隨著鹽濃度的增加，種子發芽率增加，而進一步增加鹽濃度，發芽率才受到抑制[24,25]。在種子萌發試驗中也得到了同樣的結論。

氯化鈉(NaCl)是土壤中的主要鹽，這種鹽的較高濃度對植物產生2種主要影響，即滲透和離子效應，其中滲透脅迫使植物吸收水和礦物質的能力最小化[26]。植物體內滲透調節劑主要有脯氨酸、甘氨酸、可溶性多糖和多胺等[27]。當植物受到脅迫時，體內可溶性糖和游離脯氨酸積累增加[28]，試驗結果表明，隨鹽濃度的升高，脯氨酸積累逐漸增高，新陸早65號表現最為明顯，結果與郭艷超等[26]對芙蓉種子鹽脅迫下的研究結果基本一致，鹽脅迫下脯氨酸的大量積累也是其適應鹽逆境的防御機制[29]，可作為棉花耐鹽性生理指標之一。

膜脂和膜蛋白是植物膜系統的組成部分，當植物受到鹽脅迫時，體內會產生大量的氧自由基，即活性氧，從而能夠對膜脂的氧化造成傷害。植物體中有一個抗氧化過氧化物酶系統，如超氧化物歧化酶、過氧化物酶、過氧化氫酶等, 進行協同作用可以共同抵抗鹽分脅迫所誘導的氧化傷害。SOD可以催化超氧化物歧化為分子氧和H2O2，這種酶被認為是最有效的胞內酶促抗氧化劑。隨著NaCl濃度的增加，幼葉中SOD活性研究一直不斷下降[30-31]。而史寶勝等[30]對鹽嵩種子的研究發現，處理前期隨鹽濃度的升高，酶活性增大。研究結果表明，新陸早45號棉種與對照相比，隨著鹽濃度的增加，各處理的超氧化物歧化酶(SOD)活性顯著降低；新陸早65號種子SOD活性隨鹽濃度的增加呈倒“V”型變化，0.2%和0.4%NaCl濃度處理下SOD活性與對照無顯著差異，0.8%NaCl濃度顯著降低了SOD活性。丙二醛(MDA)是膜脂過氧化的產物，可以反映膜脂過氧化的程度和植物對逆境的反應[31]。張海艷等[32]研究發現，隨NaCl濃度不斷增加，丙二醛含量也隨之升高，且耐鹽性越差。試驗結果表明，經過80 h的NaCl脅迫處理后，種子體內丙二醛含量隨著不同鹽濃度的增加而顯著升高，其中新陸早45號增幅較大，且0.8%NaCl濃度較對照相比增長達98%，新陸早65號變化較為穩定且變幅較小。

4 結 論

不同濃度鹽脅迫對2個棉花品種的發芽勢、發芽率、發芽指數有著顯著的影響，并且隨著鹽濃度的增加其抑制作用顯著增強。品種間耐鹽性強弱為新陸早65號>新陸早45號。隨NaCl脅迫處理時間的延長，過氧化氫酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、脯氨酸(Pro)呈現先升高后降低的趨勢，而可溶性蛋白(SP)則呈增加的趨勢；丙二醛(MDA)含量隨NaCl濃度的增加逐漸增加。新陸早45號和新陸早65號的SOD、CAT載荷值較高，SOD、CAT受鹽脅迫影響顯著。較低的鹽濃度可以促進種子的萌發，提高種子內的保護系統中SOD、CAT活性從而降低MDA含量，清除過多活性氧，減少種子傷害并提高耐鹽性，但是隨鹽濃度的增加，活性氧自由基代謝紊亂導致種子萌發受到抑制，不同的品種具有不同的臨界鹽濃度。