16種植物甲醇提取物對小麥萌發及幼苗生長活性篩選與評價

鄭瑞明，王 莉，張軍高，鄢 蓉，李 進，梁 晶，雷 斌，周小云

(1.新疆農業科學院核技術生物技術研究所/農業農村部荒漠綠洲作物生理生態與耕作重點實驗室，烏魯木齊 830091；2.新疆農業大學農學院，烏魯木齊 830052；3.新疆作物化學調控工程技術研究中心，烏魯木齊 830091；4.新疆綠洲興源農業科技有限責任公司，烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】農藥活性成分的篩選是研制植物源生長調節劑的前期基礎，而植物源生長調節劑較化學生長調節劑具有保護生態環境的特點，并且對病蟲害防治有著積極的作用，可以提升作物品質[1]。研究植物源生長調節劑對促進有機農業發展、保護環境具有重要意義[2]。【前人研究進展】我國現有高等植物470科，3 700余屬，近3×104種，其中有18個科具有廣泛的藥理作用及生物活性[3]。高等植物是篩選新農藥活性成分的重要資源,植物源提取物中活性物質主要包括生物堿類化合物、黃酮類化合物等，由于活性物質類別不同，不同的植物提取物具有不同的植物生長調節活性等生理特性[4-7]。番茄莖葉水提液對辣椒幼苗根表現為低濃度促進高濃度抑制作用[8]；駱駝蓬提取物有利于增強小麥根系活力，促進小麥生長[9]；桑葉提取物與化學促生劑聯合施用可以促進小麥生長，提高生產力[10]；胡蘿卜提取物有利于提高水稻種子耐低溫性以及發芽率[11]。【本研究切入點】具有生物活性成分的植物提取物能夠對作物生長發育起到調控作用。新疆具有農業藥用活性的特色植物非常多，研究也較為廣泛與深入，然而大多局限在殺蟲和殺菌的活性成分研究上，在植物生長調節等特殊活性成分篩選的研究較少。需研究分析植物甲醇提取物對小麥萌發及幼苗生長的調節作用。【擬解決的關鍵問題】以小麥生長為作物靶標，以蒸餾水處理為對照，測定小麥種子的萌發指標結合綜合評價值篩選萌發活性效果較好的植物提取物，并進行盆栽試驗驗證，測定小麥幼苗的形態特征值以及光合特性等，采用主成分分析法評價對小麥幼苗生長活性最優的植物提取物，為進一步的田間驗證提供植物源材料和研制植物源農藥新產品提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材 料

供試的16種植物樣品涉及豆科、傘形科、水鱉科等植物，供試小麥品種為新春44號，由新疆農業科學院核技術生物技術研究所提供。表1

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

參照郭小強[12]方法采用超聲波提取法提取植物樣品并配置成1.0 g/mL母液，放入4.0℃冰箱中保存備用。將16種植物提取物母液稀釋制備成10%(m/v，以下同)、1%、0.1%、0.01%的溶液備用，以蒸餾水處理作為對照。表1，表2

1.2.2 測定指標

1.2.2.1 種子萌發

參照張婷婷等[13]方法，以蒸餾水為空白對照(CK)，按不同稀釋濃度的植物提取液浸種小麥，保證浸種的植物提取液體積相等以及小麥種子數相等，使小麥完全浸沒溶液內部，浸種時間為24 h。分別于第3 d統計種子的發芽勢，第7 d統計發芽率，第8 d測定小麥芽長、根長、根數以及儲藏物質轉運率。

表1 供試植物材料Table 1 Plant material for testing

表2 供試植物提取物配制濃度及編號Table 2 Preparation concentration and number of tested plant extracts

1.2.2.2 幼苗生長指標

參照趙慧[14]方法。采用泥炭土和蛭石3∶1的復合基質土，加入適量的水保持濕度，在長和寬為10 cm的塑料花盆中，統一加入基質土按壓實至盆口1.5 cm處，均勻放入大小基本一致的小麥種子25粒，覆土至花盆口，保證土壤的深度和濕度一致，重復3次。采用噴霧法處理，統一于小麥播種14 d后噴施莖葉，均勻噴灑，以小麥葉面水珠飽和而不下滴為準，噴藥時各處理間互不影響。從盆栽小麥移入人工氣候室起至第21 d，調查小麥的株高等農藝性狀指標，每小區或每盆隨機取7株，重復3次。

1.2.2.3 幼苗地上部分內源激素

參照張玉瓊等[15]方法，于噴施植物提取液7 d后隨機采樣小麥幼苗地上部分2.0 mg，采用高效液相色譜分析吲哚乙酸(Indoleacetic acid, IAA)、赤霉素(Gibberellin 3, GA3)和脫落酸(Abscisic acid, ABA)含量。

1.2.2.4 小麥葉片光合參數

參照呂麗榮[16]方法。采用Li-6400 XT型便攜式光合儀(美國LI-COR公司)，于小麥兩葉一心期在人工氣候室測定小麥葉片的光合特性，每個處理重復10次，取平均值。光合參數測定：使用LED 2×3型紅藍光源葉室，閉合式氣路，葉室溫度設為25℃，CO2濃度約為380.0 μmol/L，光合有效輻射設定為1 800.0 μmol/(m2·S)。光合氣體交換參數主要包括胞間凈光合速率(Net photosynthesis rate，Pn)、氣孔導度(Stomatal conductance，Gs)、胞間二氧化碳濃度(Intercellular CO2concentration，Ci)、蒸騰速率(Transpiration rate，Tr)和氣孔限制值(Stomatal limiation)，計算公式如下：

其中，Ci為胞間CO2濃度，Ca為空氣CO2濃度，閉合氣路下Ca=400.0 μmol/L。

1.2.2.5 葉綠素相對含量

參照薛香[17]方法。利用日本產SPAD-502葉綠素儀于小麥2葉1心期，測定處理小麥葉片的相對葉綠素含量值(Relative chlorophyll content，SPAD value)，每個小區測定7株，每株葉片取3個不同部位測定，取平均值。

1.2.3 植物生長調節活性的綜合評價

以供試材料的測定指標為依據，利用加權隸屬函數法和主成分分析法綜合評價16種植物甲醇提取物對小麥萌發期和幼苗期的生長調節活性。加權隸屬函數法計算公式如下：

U(Xj)=[Xij-Xjmin]/[Xjmax-Xjmin]，j=1、2、3…….

1.3 數據處理

數據經Excel 2010整理后，統計分析方法使用SPSS 19.0分析生物學數據，使用GraphPad Prism 7.0軟件繪圖。

2 結果與分析

2.1 16種植物提取物的提取

研究表明，16種植物經甲醇超聲提取后提取率小于15%的共有8種，大于15%的共有8種，其中以苦草、牛至以及毒參提取率較高，分別為26.20%、21.14%、19.70%。不同植物的提取率差異較為明顯。表3

表3 16種植物甲醇提取物的提取率Table 3 Extraction rates of 16 plant methanol extracts

2.2 不同植物提取物對小麥種子萌發活性篩選

研究表明，不同濃度的16種植物提取物浸種對小麥種子萌發活性具有不同的影響。與CK比較，0.01%苦豆子提取物浸種后的發芽勢與發芽率最高，分別增加10.00%(P<0.05)、6.74%，0.01%苦草和0.01%孜然提取物浸種后的發芽勢與發芽率分別增加8.83%(P<0.05)、4.49%和7.62%(P<0.05)、3.37%；低濃度提取物具有促進芽生長作用，其中以0.01%苦豆子增幅最大，達17.95%(P<0.05)，0.01%苦草次之，達16.67%(P<0.05)；低濃度的植物甲醇提取物具有促進主根伸長作用，其中以0.01%苦豆子增幅最大，達23.44%(P<0.05)，0.01%苦草次之，達到21.88%(P<0.05)；0.01%苦豆子、0.01%大戟、0.01%黃芪等20余種植物植物甲醇提取物具有促進側根生長作用，其中以0.01%孜然增幅最大，達到20.37%(P<0.05)，0.01%苦豆子次之，達到18.52%(P<0.05)；0.01%苦豆子、0.01%苦草、0.01%黃芪等10余種植物甲醇提取物增加儲藏物質轉運率，其中以0.01%苦豆子增幅最大，達20.32%(P<0.05)。同一植物提取物不同濃度對小麥萌發的促進作用存在很大的差異，相同濃度不同植物提取物對小麥萌發的促進作用也有明顯的差異。

0.01%苦豆子提取物平均值最高為0.93；有14種濃度的植物提取物評價分在0.60～0.70，有42種濃度的植物提取物評價分在0.60以下。綜合評價值D≥0.70為標準，篩選出對小麥種子萌發期活性效果較好的8個不同濃度植物提取物：Y1-4、Y2-4、Y3-2、Y3-4、Y3-3、Y1-3、Y4-1、Y7-4。表4

表4 小麥種子萌發指標的比較Table 4 Comparison of seed germination indexes in wheat

2.3 不同植物提取物對小麥幼苗生長活性復篩

2.3.1 不同植物提取物對小麥幼苗形態指標的影響

研究表明，0.1%苦豆子、0.01%苦豆子、0.01%孜然、1%苦草、0.1%苦草、0.01%苦草、10%曼陀羅和0.01%大戟提取物對小麥幼苗形態指標有不同程度的影響。其中，與CK比較，0.01%苦豆子處理效果最好，株高提高13.99%(P<0.05)，最大葉長提高16.62%(P<0.05)；0.01%苦豆子、0.01%孜然和0.01%苦草甲醇提取物處理莖粗分別增加32.91%(P<0.05)、27.85%(P<0.05)和25.32%(P<0.05)；0.01%孜然與苦豆子處理的鮮重分別增加14.78%(P<0.05)、5.15%(P<0.05)。在這8個不同濃度植物提取物處理中，0.01%苦豆子、0.01%孜然和0.01%苦草甲醇提取物對促進小麥幼苗生長效果較好。圖1

注:圖中短線表示標準差，不同小寫字母表示處理間在P<0.05水平上差異顯著。CK：蒸餾水作為對照；Y1-3：0.1%苦豆子甲醇提取物；Y1-4：0.01%苦豆子甲醇提取物；Y2-4：0.01%孜然甲醇提取物；Y3-2：1%苦草甲醇提取物；Y3-3：0.1%苦草甲醇提取物；Y3-4：0.01%苦草甲醇提取物；Y4-1：10%曼陀羅甲醇提取物；Y7-4：0.01%大戟甲醇提取物，下同

2.3.2 不同植物提取物對小麥幼苗地上部分內源激素的影響

研究表明，不同植物提取物對小麥幼苗地上部分內源激素存在顯著差異。與CK比較，0.01%苦豆子甲醇提取物處理的IAA含量提高29.60%(P<0.05)，達到顯著差異水平，而0.01%孜然與0.01%苦草甲醇提取物處理的小麥幼苗地上部分的IAA含量有所上升，但差異不顯著。苦豆子、孜然、苦草低濃度提取物有利于增加小麥幼苗地上部分IAA含量，調控小麥幼苗的生長發育。圖2

2.3.3 不同植物提取物對小麥幼苗葉片光合特性的影響

研究表明，與CK比較，0.01%苦豆子、0.01%孜然和0.01%苦草甲醇提取物處理的小麥幼苗葉片凈光合速率分別增加10.91%(P<0.05)、6.30%和6.45%。0.01%苦豆子甲醇提取物處理小麥葉片SPAD值增加6.29%(P<0.05)。0.01%苦豆子、0.01%孜然和0.01%苦草甲醇提取物有利于促進小麥幼苗葉片的光合特性，增加營養物質積累。表5

2.3.4 不同植物提取物對小麥幼苗形態影響的綜合評價

研究表明，第1和第2主成分的特征值分別為4.36和0.97，貢獻率分別為59.68%和18.05%，累積貢獻率為77.73%，能夠反映大部分的信息，故研究提取前2個主成分作綜合評價。0.01%苦豆子甲醇提取物處理對小麥生長影響的綜合評價為2.66，在綜合評價分排在第1位，0.01%苦草與孜然提取物處理綜合評價分位列后兩位。0.01%苦豆子甲醇提取物處理對于促進小麥生長效果最佳，0.01%苦草與孜然提取物次之。表6

表5 小麥幼苗葉片光合特性的比較Table 5 Comparison of leaf photosynthetic characteristics of seedlings in wheat

3 討 論

超聲波提取法作為一種優良的提取方法，能夠提高植物提取率和不破壞提取物結構等優點[18]。超聲波提取法是能夠加快植物釋放細胞內含物的一種提取技術，具有提取率高、耗時少等優點，被廣泛運用于植物活性成分的提取工藝[19-21]。韓溶溶等[22]利用超聲波提取法得到藥西瓜提取物的提取率為25.61%；司愛富等[23]利用超聲波提取法得到植物藜提取物的提取率為16.14%。研究表明，通過甲醇溶劑超聲提取法對16種植物提取，提取率小于15%的共有8種植物，提取率大于15%的有8種植物，苦草提取物的提取率最高為26.20%。同種提取方法對于不同植物的提取率存在差異，可優化提取工藝來進一步提高植物提取率。

表6 主成分比較Table 6 Comparison of principal component

張興等[24]對西北地區的殺蟲植物資源進行調查分析后發現，西北5省區部分地區的殺蟲植物有研究和開發價值的共47種，以分屬于豆科的殺蟲植物種類最多；方濤等[25]對新疆28種藥用植物殺棉蚜活性篩選中發現曼陀羅毒力最強，并研制出曼陀羅乳油產品。研究表明，對新疆16種藥用植物進行小麥生長調節活性的篩選，利用隸屬函數法綜合評價16種植物甲醇提取物對小麥種子萌發的活性效果，以綜合評價值≥0.70為標準，Y1-4、Y2-4、Y3-2、Y3-4、Y3-3、Y1-3、Y4-1、Y7-4甲醇提取物綜合評價分較高。

研究通過盆栽驗證發現0.01%苦豆子、苦草、孜然對小麥幼苗有較好的生長調控效果。與CK相比，0.01%苦豆子、孜然和苦草提取物能夠改善小麥幼苗的農藝性狀、IAA含量與葉片葉綠素SPAD值以及凈光合速率，有利于促進小麥幼苗葉片的光合特性，增加營養物質積累，為小麥后期生長提供物質基礎。進一步通過主成分分析法，綜合評價值排序前3位的分別為0.01%苦豆子、0.01%苦草、0.01%孜然，綜合評價分分別為2.66、2.02、1.74。3種植物甲醇提取物綜合評價分最高。但是試驗僅是對苦豆子、苦草、孜然3種植物甲醇提取物在小麥種子萌發和幼苗生長方面提供數據基礎，并為新型生物防治劑的開發提供理論依據。具體的實際效果還要依賴于室外田間多環境來進行試驗，同時農藥活性受劑型、使用方式等影響較大，尚需進一步深入研究出相應的產品和施用技術。

4 結 論

苦豆子、孜然和苦草3種低濃度甲醇提取物對小麥種子萌發活性以及幼苗生長活性均具有不同程度的調控作用，能促進小麥種子的萌發，提高小麥的發芽率，平衡幼苗地上部分內源激素含量，增加幼苗的葉長與莖粗，進一步提高葉片的光合特性與葉綠素SPAD值。其中，0.01%苦豆子處理效果最優，0.01%苦草甲醇提取物次之。