甜瓜AMS基因結構分析及基因編輯載體構建

才 羿，戴冬洋，2，譚 海，王 迪，楊 芬，王 嶺，盛云燕

(1.黑龍江八一農墾大學，黑龍江大慶 163319；2.石河子大學，新疆石河子 832000；3.黑龍江省農業科學院大慶分院，黑龍江大慶 163310)

0 引 言

【研究意義】甜瓜(CucumismeloL.)是葫蘆科黃瓜屬甜瓜種一年生雙子葉蔓性草本植物。植物雄性不育是作物雜種優勢利用的主要途徑，具有重要的生產利用價值。利用雄性不育降低生產成本可以保證農作物授粉的成功率以及提高農作物產量。甜瓜具有較高的雜種優勢，應用雄性不育材料可以降低生產投入，減少花器損傷，節省田間勞動力、提高雜交制種效率，提高甜瓜產量和經濟效益。ABORTEDMICROSPORES(AMS)在擬南芥雄性不育中具有重要的作用，前期對甜瓜單細胞核雄性不育進行定位并篩選候選基因得到AMS為關鍵基因，但是其調控甜瓜雄性不育的功能尚不明確。AMS基因是甜瓜花藥發育過程中參與花粉壁合成和調控絨氈層后期的關鍵因子，其編碼bHLH類轉錄因子。若AMS基因發生異常，則不能正常形成花粉，會導致甜瓜雄性不育的發生。基因編輯載體的構建是基因功能鑒定的重要步驟?！厩叭搜芯窟M展】前期在研究甜瓜雄性不育時發現該性狀為單隱性細胞核雄性不育(Genic male sterility，GMS)類型[1-2]，該不育類型主要是由于絨氈層發育異常導致[3]，過程受到復雜機制的調控。bHLH(BasicHelixLoopHelix)蛋白參與絨氈層退化[4]，而ABORTEDMICROSPORES(AMS)基因是編碼bHLH類轉錄因子，是花粉發育的關鍵基因之一[5-8]。AMS基因是花粉壁形成的主要調節劑[2]，其在擬南芥中表達是在減數分裂前開始，并在減數分裂后表達量增加，其與其它絨氈層特定基因相比，AMS基因的表達時間更長[9]。AMS基因與絨氈層和花粉發育的雙相調節有關。盛云燕等[10]在甜瓜雄性不育基因定位的研究發現，AMS基因為甜瓜單隱性核不育性狀候選基因，經qRT-PCR技術檢測發現，該基因表達在可育植株中表達量顯著高于不育株。通過轉錄組測序技術分析可育株與不育株花蕾不同發育時期差異基因，AMS基因顯著差異表達[11]?！颈狙芯壳腥朦c】通過基因定位確定控制甜瓜單隱性核不育性狀的候選基因為AMS基因[10]，但是其調控機理尚不明確，而CRISPR/Cas9技術目前在多種作物中開展基因功能驗證，而在甜瓜方面的應用尚不廣泛。需研究鑒定甜瓜雄性不育候選基因ABORTEDMICROSPORES(AMS)的基因家族。【擬解決的關鍵問題】采用生物信息學技術鑒定甜瓜雄性不育候選基因ABORTEDMICROSPORES(AMS)家族基因，構建甜瓜AMS基因的CRISPR/Cas9植物基因敲除載體，對AMS基因進行定向編輯，為甜瓜AMS基因功能及雄性不育的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1AMS基因家族成員篩選與鑒定

前期獲得的甜瓜AMS基因(MELO3C021653.2.1)序列[12]作為目標序列，在NCBI數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和PYTOZOME數據庫(https://phytozome．jgi．doe．gov/pz/portal．html#)數據庫同源比對擬南芥AMS基因家族，篩選出帶有Helix-loop-helix DNA結構域的典型同源基因。利用PYTOZOME數據庫、https://pickle.vcru.wisc.edu/wenglab數據庫、葫蘆科基因組數據庫(http://cucurbitgenomics.org/)和NCBI數據庫同源篩選，具有典型的Helix-loop-helix DNA結構域的甜瓜AMS基因，搜索NCBI數據庫和葫蘆科數據庫兩種方法鑒定篩選甜瓜AMS基因家族成員。數據在PHYTOZOME和SMART數據庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)中對非冗余的蛋白序列進行保守結構域分析。

1.1.2AMS基因靶點的選擇及線性化載體制備

利用已發表的甜瓜AMS基因的CDS區，通過在線設計網站(http://crispr.mit.edu:8079/?)設計sgRNA并進行靶位點選擇及特異性分析。篩選出3個靶點作為AMS基因的敲除位點。表1

1.2 方 法

1.2.1 甜瓜AMS基因GRISPR/Cas9敲除載體的構建

PCR擴增體系為：DNA模板、正向引物和反向引物10 pmol各1 μL、PremixTaq3 μL，用ddH2O補足10 μL。擴增條件：95℃預變性5 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s為1個循環，進行34個循環；72℃延伸10 min，最后4℃保溫。

利用限制性內切酶BsaⅠ制備線性化載體pHSN401，酶切體系為：10×Green Buffer 1.5 μL，Bsa I (Thermo #ER0291) 0.5 μL，50588 pHSN401 2 μg，ddH2O補齊到15 μL，37℃，20 min，經瓊脂糖凝膠檢測、回收得到的線性化載體50588 pHSN401-BsaI。表1

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.2AMS-pHSN401 CRISPR/Cas9重組質粒的構建

將得到的線性化載體50588 pHSN401-BsaI分別與1∶10稀釋的退火產物相連接，連接體系為：2x buffer 5 μL，50588 pHSN401-BsaI1 μL，1∶10稀釋的退火產物1 μL，ligase (NEB #M2200) 0.5 μL，ddH2O 2.5 μL，25℃，30 min。轉化E.coliDH5α感受態細胞，在含卡那霉素(Kana)的抗性培養板篩選單克隆，菌落PCR檢測并測序驗證，分別命名為：AMS-pHSN401-1、AMS-pHSN401-2和AMS-pHSN401-3。

1.2.3AMS-pHSN401 CRISPR/Cas9重組質粒轉化農桿菌并鑒定

取-80℃保存的農桿菌感受態于室溫待其部分融化，處于冰水混合狀態時插入冰中。100 μL感受態加入適量質粒DNA，用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置5 min、液氮5 min、37℃水浴5 min、冰浴5 min。加入700 μL無抗生素的LB液體培養基，于28℃振蕩培養2～3 h。6 000 r/min離心1 min，留取100 μL左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含Kana的LB平板上，倒置放于28℃培養箱培養2～3 d。待平板長出單克隆，挑單克隆搖菌，進行PCR鑒定。

1.3 數據處理

1.3.1AMS基因進化

利用MEGA 7.0軟件對擬南芥、黃瓜、甜瓜、番茄等物種AMS同源基因進行系統進化分析，采用鄰接(Neighbor-Joining，NJ)法構建系統進化樹，并設置bootstrap為1 000檢驗，分析不同物種蛋白系統間的親緣關系以及系統進化關系。

1.3.2AMS基因理化性質、亞細胞定位預測及染色體定位

AMS基因蛋白的等電點、分子量采用Expasy ProtParam(http://web．expasy．org/protparam/)進行分析，并用WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)預測基因亞細胞定位。通過葫蘆科基因組數據庫(http://cucurbitgenomics.org/)和NCBI數據庫(http://blast．ncbi．nlm．nih．gov/Blast．cgi)分析甜瓜AMS同源基因在染色體上的位置。

1.3.3AMS相關基因基序預測、保守結構域和二級結構預測

通過MEME(http://meme-suite.org/)對AMS基因保守基序進行分析。利用SMART數據庫(http://smart.embl-heidelberg.de/)對AMS基因進行保守結構域分析，并利用IBS 1.0軟件進行可視化分析。甜瓜AMS基因的二級結構和各二級結構所占比例采用在線SOPMA數據庫(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl page=/NPSA/npsa_sopma.html)進行在線預測。

2 結果與分析

2.1 AMS基因生物信息學分析

2.1.1AMS基因進化

研究表明，42個AMS同源基因共分為3個亞族，其中5個甜瓜AMS基因被分為2個亞族，亞族Ⅱ未發現甜瓜AMS基因；剩余2個亞族中，甜瓜AMS基因與黃瓜AMS基因進化關系較近，同源性較高，與擬南芥和番茄的親緣關系較遠，甜瓜AMS基因(MELO3C021653.2.1)在亞族Ⅲ。 圖1

圖1 甜瓜、擬南芥、黃瓜和番茄AMS基因的系統發育關系Fig.1 Phylogenetic relationships of AMS genes from melon, arabidopsis, cucumber and tomato

2.1.2 甜瓜AMS基因理化性質及染色體定位

研究表明，甜瓜AMS蛋白從501～605 aa不等，平均分子量約為59 351 Da，等電點為5.04～6.45，大部分甜瓜AMS基因定位于細胞核中，也有部分存在胞間層和細胞質中。其中目標序列MELO3C021653.2.1，氨基酸數目為605 aa，等電點為5.04，帶正電荷，亞細胞預測該基因位于細胞核。5個甜瓜AMS基因分別定位在第4、6、9號染色體上。表2

表2 甜瓜AMS基因理化性質及染色體定位Table 2 Physicochemical properties and chromosome location of AMS gene in Melon

2.1.3 甜瓜AMS基因的保守元件及結構域預測

研究表明，在5個甜瓜AMS基因氨基酸序列中鑒定出10個保守基序，甜瓜MELO3C021653.2.1基因含有保守基序1、5、8、9；所有甜瓜AMS基因均含有保守基序1，保守基序1是甜瓜AMS基因家族蛋白最重要的保守基序。甜瓜AMS基因家族的保守結構域相對單一，多數蛋白只具有一個保守結構域HLH(Helix-Loop-Helix)，少數蛋白還具有低復雜性區域。圖2

圖2 甜瓜AMS基因保守元件及結構域預測Fig.2 Conserved motif and Domains analysis of AMS genes in Melon

2.1.4 甜瓜AMS基因編碼蛋白結構預測

研究表明，AMS基因(MELO3C021653.2.1)二級結構主要由α-螺旋和無規則卷曲構成，延伸鏈(Extended strand)和β-轉角(Beta turn)主要分布在蛋白的兩邊，無規卷曲(Random coil)所占比例最高，占52.07%，α-螺旋(Alpha helix)所占比例也達到33.06%。表3、圖3

表3 甜瓜AMS基因各二級結構所占比例Table 3 Proportions of secondary structure of AMS genes

圖3 甜瓜AMS基因二級結構預測Fig.3 Prediction of secondary structure of AMS gene in Melon

2.2 AMS-pHSN401基因敲除載體的構建

研究表明，設計篩選出3個靶位點，3個靶點位于甜瓜MELO3C021653.2.1基因的CDS區。利用限制性內切酶BsaI制備線性化載體pHSN401。將構建好的甜瓜MELO3C021653.2.1質粒AMS-pHSN401-1、AMS-pHSN401-2和AMS-pHSN401-3分別轉化農桿菌，獲得AMS-pHSN401基因敲除載體。圖4

注:M：DL4500 DNA Maker；+：陽性對照；1、2、3分別為質粒AMS-pHSN401-1、AMS-pHSN401-2和AMS-pHSN401-3

3 討 論

甜瓜具有較高雜種優勢[13]，雄性不育材料的應用可減少制種成本，為育種提供良好的親本材料[14]。植物雄性不育受遺傳基因、物質代謝、激素、溫度、光照等多種因素影響[15]，在擬南芥中發現大量與雄性不育相關基因(DYT1、AMS1、MS等)，在影響孢子減數分裂、絨氈層降解、花粉形成方面具有與重要作用[16]。AMS具有調節絨氈層分泌、形成花粉壁物質，以及在小孢子和未成熟花粉粒中影響絨氈層到心室的物質轉運等功能[17]。戴艷麗等[18]2019年利用大蔥中對ALS基因進行克隆并開展CRISPR/Cas9載體構建，為大蔥抗除草劑新品種的選育奠定了良好的基礎；岳寧波等[19]2020年利用CRISPR/Cas9技術設計3個靶標位點定點編輯SlMAPK6，并獲得突變體CRISPR-3和CRISPR-7，所有突變植株表現出根系更發達、側枝增多的表型，SlMAPK6在番茄植株形態建成的過程中發揮了重要作用。試驗對甜瓜的AMS基因進行了生物信息學分析并且構建了甜瓜雄性不育關鍵基因AMS基因敲除載體。明確了甜瓜AMS基因的進化關系，對甜瓜的AMS基因進行了理化性質的分析以及染色體位置的預測，對甜瓜AMS基因的保守元件，結構域及蛋白結構進行了預測，甜瓜AMS基因家族的多樣性。

遺傳轉化是實現基因功能驗證和基因快速轉育的重要手段，但目前甜瓜的遺傳轉化體系尚不穩定，可選取材料范圍比較窄，外源基因種類比較少等。

近年來CRISPR/Cas9系統經過不斷優化升級，其功能日益增強，應用范圍逐步擴大。與其他基因編輯技術相比具有操作簡便、靈活、效率高的優勢[20-21]。

王雪等[22]采用CRISPR-Cas9基因組編輯技術，構建CRISPR-Cas9系統敲除甜瓜ACC合成酶基因表達載體的方法，利用“老漢瓜”品種的甜瓜ACC合成酶的基因成功的構建了敲除載體，為培育甜瓜的耐貯保鮮品種打下了基礎。楊晶等[23]利用CRISPR-Cas9系統基因組編輯技術，構建了甜瓜eIF4E基因敲除載體。

4 結 論

甜瓜AMS基因家族經生物信息學分析，編碼甜瓜AMS基因蛋白長度從501～605 aa不等，并且具有相同的保守結構域HLH，AMS基因主要被預測在細胞核中表達。CRISPR/Cas9基因編輯技術在育種方向上具有應用前景，構建甜瓜敲除重組載體AMS-pHSN401并轉化到了農桿菌中，經檢測已獲得陽性菌落。