基于高通量測(cè)序?qū)σ鹛O(píng)果外觀(guān)異常病原的鑒定

李春艷，劉芳婷，張王斌

(塔里木大學(xué)/南疆農(nóng)業(yè)有害生物綜合治理兵團(tuán)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部阿拉爾作物有害生物科學(xué)觀(guān)測(cè)實(shí)驗(yàn)站，新疆阿拉爾 843300)

0 引 言

【研究意義】蘋(píng)果(Maluspumila)薔薇科蘋(píng)果亞科蘋(píng)果屬植物[1]。2019年新疆蘋(píng)果種植面積2.3×104余hm2[2]由病毒和類(lèi)病毒引起的蘋(píng)果外觀(guān)異常，導(dǎo)致蘋(píng)果品質(zhì)變劣，產(chǎn)量下降[3-4]?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】類(lèi)病毒是迄今為止發(fā)現(xiàn)的最小病原物，是一類(lèi)單鏈共價(jià)閉合環(huán)狀的裸露RNA分子,通常含330個(gè)左右核苷酸[5-7]。類(lèi)病毒病害在我國(guó)蘋(píng)果上發(fā)生的主要有三個(gè)：蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒 (Apple scar skin viroid，ASSVd)、蘋(píng)果皺果類(lèi)病毒 (Apple fruirt crinkle viroid，AFVCd)、蘋(píng)果凹果類(lèi)病毒 (Apple scar skid viroid，ADFVd)[8]。病毒病病害在我國(guó)蘋(píng)果上發(fā)生的主要有6種[9-10]：蘋(píng)果莖溝病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)、蘋(píng)果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)、蘋(píng)果莖痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV) 如蘋(píng)果綠皺果病毒(Apple green crinkle virus，AgrCV)、蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)和蘋(píng)果花葉病毒(Apple mosaic virus ,ApMV)。蘋(píng)果外觀(guān)異常與蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒病病狀相似，侵染后通常表現(xiàn)為銹果型、花臉型、銹果-花臉混合型、環(huán)斑型和綠點(diǎn)型等癥狀[11-12]。已有在新疆蘋(píng)果樹(shù)、梨樹(shù)、杏樹(shù)、桃樹(shù)上蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒的報(bào)道[13-15]。【本研究切入點(diǎn)】有關(guān)基于高通量測(cè)序?qū)σ鹦陆⒗瓲柼O(píng)果外觀(guān)異常病原的鑒定文獻(xiàn)較少，以高通量基因測(cè)序技術(shù)[16]為研究手段，需對(duì)引起阿拉爾蘋(píng)果外觀(guān)不同情況異常病原進(jìn)行鑒定分析。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】采用田間調(diào)查和高通量基因測(cè)序技術(shù)，調(diào)查與分析引起阿拉爾蘋(píng)果外觀(guān)異常的病原種類(lèi)、癥狀、發(fā)生情況，確定引起阿拉爾蘋(píng)果外觀(guān)異常的病毒種類(lèi)，為防治該病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材 料

于2019年10月新疆阿拉爾六團(tuán)一連(N40°57′42″，E80°28′49″，海拔1 070 m)不同蘋(píng)果園隨機(jī)采集6份有顯著癥狀的蘋(píng)果果實(shí)樣品和無(wú)明顯癥狀的枝條樣品。表1

表1 樣品基本信息Table 1 Basic sample information

1.2 方 法

1.2.1 發(fā)病率調(diào)查

選取新疆阿拉爾六團(tuán)一連西一壟、西二壟、西三壟、西四壟地塊為調(diào)查地，在每壟各個(gè)果園中用五點(diǎn)取樣法分別選取40株果樹(shù)，記錄栽植信息，描述癥狀并統(tǒng)計(jì)發(fā)病率。表2

表2 調(diào)查地基本信息Table 2 Basic information of the survey site

1.2.2 蘋(píng)果病毒分子檢測(cè)宏轉(zhuǎn)錄組法

1.2.2.1 RNA提取

組織樣品RNA提取采用 TRizol 試劑(天根生化科技(北京)有限公司)進(jìn)行提取。

1.2.2.2 建庫(kù)測(cè)序

利用帶有Oligo(dt)的磁珠對(duì)含有ploy(A)尾的mRNA富集，將mRNA打斷成短片段合成cDNA，純化后末端修復(fù)、加A尾并連接測(cè)序接頭，最后進(jìn)行PCR擴(kuò)增。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用DPS7.55軟件進(jìn)行差異顯著性分析(α= 0.05)。

對(duì)原始下機(jī)數(shù)據(jù)(Raw Data)進(jìn)行預(yù)處理，得到有效數(shù)據(jù)(Clean Data)。數(shù)據(jù)使用Trimmomatic軟件進(jìn)行質(zhì)控，質(zhì)控后將得到高質(zhì)量序列clean reads，然后基于有效數(shù)據(jù)進(jìn)行宿主數(shù)據(jù)去除，分析病毒物種分類(lèi)分析和復(fù)雜度，拼接與組裝等。

將測(cè)序得到的各病毒基因序列通過(guò)MEGA7.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)，采用 Clustal W算法對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)，采用鄰接法(Neighbor-joining，NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，自展校正值設(shè)為1000，其余使用軟件默認(rèn)設(shè)置。構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)的序列來(lái)自于 NCBI。表3

表3 GenBank 已登錄蘋(píng)果全長(zhǎng)基因組的分離株Table 3 GenBank has logged into the isolates of the full length apple genome

2 結(jié)果與分析

2.1 蘋(píng)果外觀(guān)異常分類(lèi)描述

研究表明，田間蘋(píng)果外觀(guān)異常表現(xiàn)為果實(shí)畸形型、裂果型、和著色異常型3種類(lèi)型。果實(shí)畸形型：果實(shí)表面不平滑，呈縱向凹陷狀，色澤分布不均勻；裂果型：果面或果頂部出現(xiàn)銹斑，不規(guī)則的銹斑從蘋(píng)果頂部向四周蔓延，嚴(yán)重時(shí)果實(shí)銹斑處開(kāi)裂；著色異常型:果實(shí)從著色時(shí)開(kāi)始表現(xiàn)癥狀，在果面出現(xiàn)近圓形黃綠色斑塊，表現(xiàn)出紅黃相間的“花臉狀”，著色部分隆起，用手摸起來(lái)凹凸不平。其中黃綠色病斑面積與果實(shí)的表面積之比依次遞增。圖1～3

注:A:底部俯視圖 B:正面俯視圖 C：背面俯視圖

注:A: 黃元帥田間表現(xiàn)；B：新世紀(jì)正面俯視圖；C:新世紀(jì)底部俯視圖

注:A-D：短枝富士田間癥狀觀(guān)察結(jié)果

2.2 不同品種間蘋(píng)果外觀(guān)異常癥狀及發(fā)病情況

研究表明，不同品種間發(fā)病率與癥狀表現(xiàn)有所差異，王林的發(fā)病率最高為74.50%，與新世紀(jì)的發(fā)病率存在顯著差異，表現(xiàn)為畸形癥狀；其次是短枝富士，發(fā)病率為70.50%，與王林、新世紀(jì)間的發(fā)病率差異不顯著，表現(xiàn)為著色異常、裂果癥狀；發(fā)病率最低的為新世紀(jì)，達(dá)到了63.50%，表現(xiàn)為著裂果癥狀。3個(gè)品種間發(fā)病率雖有差異，但不顯著。表4

表4 不同品種間蘋(píng)果外觀(guān)異常發(fā)病率比較Table 4 Comparison of the incidence of apple appearance abnormality among different varieties

2.3 不同地塊間蘋(píng)果外觀(guān)異常發(fā)病比較

研究表明，對(duì)不同地塊間蘋(píng)果外觀(guān)異常發(fā)病率調(diào)查結(jié)果進(jìn)行分析，西一壟的發(fā)病率最高為83.20%，分別與西三壟、西四壟間發(fā)病率存在顯著差異；其次是西二壟發(fā)病率78.20%，與西四壟間發(fā)病率存在顯著差異；西三龍發(fā)病率為73.20%，分別與西一壟、西四壟間發(fā)病率存在顯著差異；西四壟的發(fā)病率最低為47.20%，與其他3壟的發(fā)病率存在顯著差異。表5

表5 不同果園蘋(píng)果外觀(guān)異常發(fā)病率比較Table 5 Comparison of the incidence of abnormal apple appearance in different orchards

2.4 蘋(píng)果外觀(guān)異常病原系統(tǒng)進(jìn)化

研究表明，在王林上檢測(cè)到5種病毒，分別為ASGV、ACLSV、ASPV、AgrCV、ApMV；在短枝富士上檢測(cè)到3種病毒，分別為AgrCV、ASPV、ASGV；在新世紀(jì)上檢測(cè)到4種病毒，分別為ASGV、ACLSV、ASPV、AgrCV。王林、短枝富士、新世紀(jì)都檢測(cè)到了蘋(píng)果莖溝病毒，DZFS-ASGV和WL-ASGV親緣關(guān)系最近共同聚在一個(gè)分支上，但XSJ-ASGV與相似性為63%的印度蘋(píng)果分離株(LT160740)親緣關(guān)系最近聚在另一個(gè)分支上。王林、新世紀(jì)上也檢測(cè)到了蘋(píng)果褪綠葉斑病毒，WL-ACLSV和XSJ- ACLSV與相似性為100%的分離株(M58152)親緣關(guān)系最近共同聚在一個(gè)分支上。王林、短枝富士、新世紀(jì)也檢測(cè)到了蘋(píng)果綠皺果病毒，XSJ-AgrCV和WL-AgrCV親緣關(guān)系最近共同聚在一個(gè)分支上，但DZFS-AgrCV與相似性為96%的加拿大蘋(píng)果分離株(HE963831)親緣關(guān)系最近聚在另一個(gè)分支上。王林、短枝富士、新世紀(jì)也都檢測(cè)到了蘋(píng)果莖痘病毒，但都分別聚在不同的分支上WL- ASPV與相似性為100%的日本分離株(AB045371)親緣關(guān)系最近聚在一個(gè)分支上，DZFS-ASPV與相似性為99%的印度分離株(FR694186)親緣關(guān)系最近聚在另一個(gè)分支上，XSJ-ASPV單獨(dú)為一個(gè)分支。表6，圖4

表6 蘋(píng)果外觀(guān)異常攜帶病毒種類(lèi)Table 6 The apple appears to carry an abnormal virus type

圖4 蘋(píng)果分離物核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育Fig.4 Phylogenetic analysis of nucleotide sequences from apple isolates

3 討 論

蘋(píng)果果實(shí)外觀(guān)異常原因較為復(fù)雜，已經(jīng)報(bào)道的主要是蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)引起的。不同品種蘋(píng)果外觀(guān)異常田間表現(xiàn)癥狀不同與時(shí)丕坤[17]觀(guān)察結(jié)果一致。高通量測(cè)序技術(shù)檢測(cè)出在3種不同品種、不同表現(xiàn)癥狀的蘋(píng)果中均攜帶蘋(píng)果莖溝病毒(ASGV)、蘋(píng)果莖痘病毒(ASPV)、蘋(píng)果綠皺果病毒(AgrCV)，李鵬舉等[18]在黑龍江省不同蘋(píng)果產(chǎn)區(qū)的不同品種的蘋(píng)果上也均檢測(cè)到了蘋(píng)果莖溝病毒(ASGV)。研究表明ASGV、ASPV、ACLSV在蘋(píng)果樹(shù)中呈混合侵染與楊潔萍等[19]結(jié)果一致。根據(jù)高通量測(cè)序結(jié)果顯示，檢測(cè)到的病毒有蘋(píng)果褪綠葉斑病毒(Apple chlorotic leaf spot virus，ACLSV)、蘋(píng)果莖痘病毒(Apple stem pitting virus，ASPV)、蘋(píng)果莖溝病毒(Apple stem grooving virus，ASGV)、蘋(píng)果花葉病毒(Apple mosaic virus，ApMV)和蘋(píng)果綠皺果病毒(Apple green crinkle virus，AgrCV)5種類(lèi)型，并未檢測(cè)到有蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒(Apple scar skin viroid，ASSVd)，但多病毒病的混合發(fā)生也表現(xiàn)出了類(lèi)似蘋(píng)果銹果類(lèi)病毒病的癥狀，有待深入研究。

蘋(píng)果類(lèi)病毒和病毒病害目前無(wú)有效防治手段，加強(qiáng)果園管理可緩解病害癥狀的表現(xiàn)[20]，使用套袋技術(shù)可以促進(jìn)蘋(píng)果果面著色、提高果實(shí)的貯藏性和果實(shí)的商品價(jià)值[21]，但無(wú)法徹底根除及解決風(fēng)味變差的問(wèn)題。發(fā)病率的差異可能與果園土肥水管理，土壤情況，營(yíng)養(yǎng)不均衡，樹(shù)體衰弱，病毒容易入侵，負(fù)載量大等有關(guān)[22]?？梢酝ㄟ^(guò)肥水管理措施，增強(qiáng)樹(shù)勢(shì)，提高樹(shù)體的免疫力。合理負(fù)載，平衡樹(shù)勢(shì)，減小留果密度，及時(shí)補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)等措施減輕病害的發(fā)生[23-24]。蘋(píng)果一旦感染上病毒，很難防治，目前蘋(píng)果病毒病尚無(wú)有效的防治藥劑，只能通過(guò)預(yù)防手段加以控制，發(fā)現(xiàn)病株，立即拔除。培育無(wú)病毒母本，栽培無(wú)病毒苗木，加強(qiáng)植物檢疫是防治病毒病的有效方法[25]。

4 結(jié) 論

4.1蘋(píng)果外觀(guān)異常田間癥狀主要有果實(shí)畸形型、銹果型、著色異常型三種類(lèi)型。不同品種間病害癥狀表現(xiàn)有所差異。短枝富士表現(xiàn)為著色異常、裂果癥狀，攜帶病毒為AgrCV、ASPV、ASGV。王林主要表現(xiàn)為畸形癥狀，攜帶病毒為ASGV、ACLSV、ASPV、AgrCV、ApMV。新世紀(jì)表現(xiàn)為裂果癥狀，攜帶病毒為ASGV、ACLSV、ASPV、AgrCV。

4.2新疆阿拉爾蘋(píng)果外觀(guān)異常在阿拉爾六團(tuán)一連平均發(fā)病率為70.45%。對(duì)不同品種間發(fā)病率比較分析，王林的發(fā)病率為74.50%，短枝富士發(fā)病率為70.50%，新世紀(jì)的發(fā)病率為63.50%，同一地塊不同品種間的發(fā)病率無(wú)規(guī)律性。西一壟的發(fā)病率為83.20%，西二壟的發(fā)病率為78.20%，西三壟的發(fā)病率為73.20%，西四壟的發(fā)病率為47.20%，蘋(píng)果外觀(guān)異常發(fā)病率與不同地塊間無(wú)相關(guān)性。