菌根真菌對60Co-γ輻射后鐵皮石斛種子萌發的影響

王淑華 馬艷軍，3 姚 娜 范可可 胡曉萌 江澤慧，* 胡 陶，3，*

（1國際竹藤中心/國家林業和草原管理局重點實驗室/北京竹藤科技研究中心，北京 100102；2中國林業科學研究院林業研究所/國家林業和草原局林木培育重點實驗室，北京 100091；3廣西憑祥竹林生態系統國家定位觀測研究站，廣西 憑祥 532600）

鐵皮石斛（Dendrobium candidum）為蘭科多年生草本植物，是我國傳統名貴藥材，同時具有重要的生態價值和觀賞價值［1-2］。當前，野生鐵皮石斛資源瀕臨滅絕［3］，在保護鐵皮石斛野生資源的前提下培育新品種將有助于石斛產業的發展［4］。60Co-γ 輻射誘變因其成本低、穿透力強、突變率高等優勢，與常規育種技術結合，在百合、牡丹、菊花等觀賞植物中已得到廣泛應用［5-7］。

種子是輻射誘變中常用的材料［8-10］，但目前蘭科植物誘變育種中多利用幼苗［11］、根狀莖［12］和原球莖［13］作為輻射材料，輻射處理種子的相關研究較少。原因之一在于蘭科植物種子細小，較難萌發，輻射對其損傷嚴重，顯著降低其萌發率。有報道表明化學處理（水楊酸、褪黑素、赤霉素等）、光譜處理及激光或微波處理等可在一定程度上緩解植物輻射損傷，并提高其誘變率［14-16］。此外，60Co-γ 輻射會顯著降低植物內生真菌種群的多樣性，破壞內生真菌群落的穩定性［17］，而對于真菌共生型植物，菌根真菌可增強植物的抗輻射能力［18］。其中鐵皮石斛是典型的菌根真菌共生植物，自然條件下菌根真菌對鐵皮石斛種子萌發和幼苗生長具有重要作用［19］。

鑒于此，本研究選取顯著促進鐵皮石斛種子萌發的膠膜菌屬菌株JL2、JL4，使其與60Co-γ輻射后的鐵皮石斛種子建立共生關系，比較與菌株JL2、JL4 共生萌發和在1/2MS培養基上非共生萌發這兩類不同處理條件下，種子萌發率、成苗率的差異，分析菌根真菌對輻射后種子萌發和幼苗生長的影響，探索菌根真菌共生對促進鐵皮石斛輻射突變材料的恢復培養和擴繁培養的潛在作用，以期為提高蘭科植物種子輻射誘變育種效率提供數據依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

鐵皮石斛（Dendrobium candidum）、建蘭（Cymbidiumensifolium）栽培于國際竹藤中心溫室，植株生長健康。于2021 年4—5 月對鐵皮石斛進行授粉，同年11 月前收集成熟未開裂蒴果（圖1-A），于4 ℃條件下保存。

圖1 鐵皮石斛蒴果與菌根真菌菌落形態Fig.1 Capsules of D.candidum and morphology of mycorrhizal fungi

供試菌株JL2 與JL4 為分離自建蘭根部的兩株菌根真菌（圖1-B、C），將其與鐵皮石斛種子共生萌發，為確定菌株在鐵皮石斛原球莖中的定殖情況，對其進行真菌特異性染色［20］。

1.2 儀器與設備

YT-CJ-2N 型超凈工作臺，北京亞泰科隆實驗科技開發中心；Axiocam Erc 5s Rev.2.0 體視顯微鏡，德國Cart Zeiss顯微鏡有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 輻射處理 將蘭花蒴果表面用75%乙醇擦拭消毒，在超凈工作臺內剖開分裝至1.5 mL 無菌離心管中，在安徽合肥（國家）林業輻照中心進行60Co-γ 輻射處理，輻射劑量為0（CK）、20、40、60、90、120 Gy，劑量率為32.2 Gy·h-1，不同劑量梯度通過輻射時間控制。

1.3.2 輻射后種子萌發 在超凈工作臺內，用無菌水將各劑量輻射后的種子制成懸浮液，播種于4 種不同條件的培養基。依據是否接種真菌，培養條件可分為非共生萌發［1/2MS培養基（murashige and skoog medium with half strength MS macronutrients）、燕麥培養基（oat meal agar medium，OMA）］和共生萌發（OMA 培養基+菌株JL2、OMA培養基+菌株JL4）。

培養基主要成分如下：1/2MS 培養基［1/2MS +6-苯甲基腺嘌呤（6-Benzylaminopurine，6-BA）0.5 mg+ α-萘乙酸（α-Naphthaleneacetic acid，NAA）0.1 mg+ 蔗糖30.0 g + 瓊脂6.0 g +活性炭 0.03 g +去離子水1 000 mL，pH值6.3～6.5］和OMA培養基［1.0 g燕麥粉（Solarbio?，北京）+ 6.0 g 瓊脂 + 1 000 mL 去離子水，自然pH 值］。在輻射種子共生萌發中，將各劑量輻射處理種子播于OMA 培養基上，并接種培養7 d 的真菌菌株。每個培養皿中播種800～1 000 顆種子，各處理設3 個重復。培養條件：溫度（23±2）℃，光照強度1 600～2 000 lx，光周期14 h光/10 h暗。

1.3.3 菌根真菌的培養與鑒定 菌株JL2（NCBI登錄號：OP132532）和JL4（NCBI 登錄號：OP132533）培養在馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）培養基（Difco，美國）上，（25±2）℃暗培養。

為了確定菌株JL2 和JL4 在膠膜菌屬真菌中的分類地位，從NCBI 數據庫中下載已報道的膠膜菌屬菌株的ITS 序列，采用MEGA-X 軟件中的最大似然法（maximum likelihood，ML）構建系統發育樹，選用K2 +G模型，設1 000次重復。

1.3.4 鐵皮石斛種子萌發率、成苗率統計 參照Stewart等［21］的方法，并進行適當修改，用0～5個階段對種子萌發和原球莖生長情況進行分級描述，將發育至第2階段的種子視為萌發（圖2），在體視顯微鏡下統計種子的萌發率和成苗率，計算相對萌發率。

式中，S0～S5分別代表鐵皮石斛種子萌發的第0階段至第5階段。

1.4 統計分析

利用SPSS 22.0 軟件，對不同萌發條件下輻射劑量0（CK）、20、40、60、90、120 Gy 及其對應的種子相對萌發率進行線性回歸分析。建立擬合線性回歸方程Y= bX+ a，求算參數a、b 的值和決定系數（R2），以檢驗方程擬合優度；其中，Y為種子相對萌發率，X為輻射劑量；Y=50%時的X值為半致死劑量（LD50）［22］。運用SPSS 22.0 軟件，將種子萌發率和成苗率的百分數結果進行反正弦轉換：y= sin-1x；將轉換后的數據進行方差分析和事后多重比較。當方差齊性時，事后多重比較采用LSD 法；方差不齊時，采用Games-Howell法。

2 結果與分析

2.1 菌根真菌分子鑒定與定殖觀察

由系統發育樹（圖3）可知，JL2、JL4 為膠膜菌屬（Tulasnellasp.）菌株。對與真菌共生萌發的原球莖進行染色，結果表明，真菌菌絲可定殖在原球莖基部細胞內，形成蘭科菌根典型的胞內菌絲團結構（圖4）。

圖3 菌根真菌菌株JL2、JL4的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of mycorrhizal fungi JL2 and JL4

圖4 真菌在鐵皮石斛原球莖和細胞內的定殖Fig.4 Fungal colonization in D.candidum protocorm and cell

2.2 60Co-γ輻射對鐵皮石斛種子萌發的影響

培養50 d 時統計鐵皮石斛種子的萌發率，計算相對萌發率。由表1 可知，不同劑量輻射后的鐵皮石斛種子在非共生萌發（1/2MS）和共生萌發（菌株JL2、JL4）培養條件下，萌發率均隨輻射劑量的升高而降低，其中，20 Gy處理的種子萌發率顯著高于其他輻射劑量處理種子萌發率，40 和60 Gy 處理下的種子萌發率差異不顯著（表1）；在OMA 培養基上非共生萌發的種子均未萌發；輻射劑量為40、60 和120 Gy 時，與菌株JL2共生萌發的種子相對萌發率最高；輻射劑量為20 和90 Gy 時，非共生萌發（1/2MS）的種子相對萌發率最高。

表1 不同60Co-γ輻射劑量對鐵皮石斛種子萌發率的影響Table 1 Effects of different radiation doses on germination rates of D.candidum seeds /%

以表1中6個輻射劑量梯度和相對萌發率為基礎，得到1/2MS 萌發條件下的線性回歸方程為y=-0.809x+ 100.266（R2=0.962），LD50為62 Gy；與菌株JL2 共生萌發條件下的線性回歸方程為y= -0.739x+100.973 （R2=0.946），LD50為69 Gy；與菌株JL4 共生萌發條件下的線性回歸方程為y= -0.786x+ 99.253（R2=0.978），LD50為63 Gy（圖5）。結果表明，與菌株JL2、JL4 共生萌發的鐵皮石斛種子半致死劑量均高于1/2MS培養基上萌發的種子，其中與菌株JL2共生萌發的種子半致死劑量較1/2MS培養基上萌發種子提高了7 Gy。

圖5 輻射劑量與相對萌發率的相關性分析Fig.5 The correlation analysis of irradiation dose with relative germination rate

2.3 60Co-γ輻射對鐵皮石斛成苗率的影響

分別在培養50 和115 d 時統計鐵皮石斛的成苗率，以確定不同培養條件下輻射對早期幼苗形成的影響（表2）。培養50 d 時，在1/2MS 培養基上僅20 Gy 處理有幼苗形成，成苗率為3.02%（圖6、表2）；與菌株JL2、JL4 共生萌發條件下，20 Gy 處理種子的成苗率顯著高于對照（0 Gy）和其他輻射劑量，分別為11.92%和36.94%，在非共生培養OMA 培養基上所有處理均無幼苗形成（圖6、表2）。

培養115 d 時，在1/2MS、JL2 和JL4 三種培養條件下，0 Gy 和20 Gy 處理成苗率差異不顯著，但顯著高于其他輻射劑量（表2）；在與半致死劑量最接近的60 Gy處理下，石斛種子與菌株JL2、JL4 共生萌發的成苗率顯著高于1/2MS 培養基上的種子成苗率（P＜0.05），其中與菌株JL4 共生萌發成苗率可高達3.74%；當輻射劑量提高至90 Gy 時，共生萌發種子的成苗率依然顯著高于1/2MS 培養基上萌發的種子（P＜0.05）；在非共生培養OMA培養基上均無幼苗形成，其中0、40、60、90和120 Gy處理種子均處于萌發的第2階段，而20 Gy處理種子與上述種子相比較為膨大，且部分種子到達原球莖階段（圖6）。由此可見，輻射劑量20 Gy 可促進鐵皮石斛快速形成幼苗；與菌株JL2、JL4 共生萌發可顯著提升種子在高輻射劑量（＞60 Gy）下的成苗率。

圖6 輻射劑量和萌發方法對鐵皮石斛種子萌發的影響Fig.6 Effect of various irradiation doses and germination method on the germination of D.candidum seeds

表2 不同60Co-γ輻射劑量對鐵皮石斛成苗率的影響Table 2 Effects of different radiation doses on seedling formation rates of D.candidum seeds /%

2.4 60Co-γ輻射對幼苗形態的影響

培養96 d 時，在顯微鏡下觀察不同培養條件下各劑量輻射種子的幼苗生長情況。由圖7 可知，與菌株JL4 共生萌發形成的鐵皮石斛幼苗長勢最好，其中90和120 Gy 處理下幼苗個體較大，表現出葉面積大、假鱗莖粗壯、根系發達（圖7）；與菌株JL2 共生萌發條件下，同樣表現出90 Gy 處理種子形成的的幼苗個體較大，但120 Gy 處理種子未形成幼苗，僅有原球莖形成；然而，與菌株JL2、JL4 共生萌發條件下，60 Gy 處理種子形成的石斛幼苗個體較其他劑量小（圖7）。與共生萌發培養條件相比，40～120 Gy 輻射處理種子在1/2MS培養基上萌發形成的幼苗生長較緩慢，葉片尚未展開（圖7）。由此可見，經輻射處理的種子與菌株JL2、JL4共生萌發可促進其幼苗生長，獲得更加健壯的幼苗。

圖7 各劑量輻射處理的鐵皮石斛種子在不同培養條件下形成的幼苗形態Fig.7 Seedlings morphology of D.candidum seeds treated with various radiation doses under different culture conditions

3 討論

3.1 鐵皮石斛種子半致死劑量

60Co-γ 輻射具有誘變突變頻率高、加快新品種選育進程的潛力。適宜的輻射劑量有利于獲得更多的有效突變，在一定范圍內提高輻射劑量可增加誘變材料的突變率，但輻射劑量過高則會大大降低其成活率［23］。半致死劑量是保證植物材料存活并獲得最大變異率的最佳劑量，其作為衡量適宜輻射劑量的重要標準在植物輻射育種中廣泛應用［24］。石斛輻射誘變主要以原球莖［25］或組培苗［11］為材料，半致死劑量主要集中于30～70 Gy。本研究通過3 種不同培養條件對60Co-γ 輻射處理鐵皮石斛種子進行萌發試驗，發現種子半致死劑量為62～69 Gy，與已報道的輻射鐵皮石斛原球莖的半致死劑量67.23 Gy 接近［26］，原因可能與誘變所用的種子材料處于成熟未休眠狀態有關，為輻射鐵皮石斛種子的劑量范圍選用提供了參考。

3.2 60Co-γ輻射對鐵皮石斛成苗率的影響

不同劑量的電離輻射會對植物的生長和發育產生不同的影響，如低劑量電離輻射對生長激素、細胞分裂素的合成和植物生長有刺激作用，而高劑量輻射對植物營養生長有抑制作用［27-28］。本研究發現，20 Gy處理對不同培養條件下石斛種子萌發、成苗均具有促進作用，這與Dehgahi 等［25］發現低劑量γ 射線可微弱促進D.Sonia28 原球莖生長的結果相一致。然而隨輻射劑量的增加，各培養條件下輻射處理種子的成苗率逐漸降低，表明更高劑量的60Co-γ輻射會抑制幼苗形成，推測其原因在于高劑量輻射使種子受到較大傷害，種子活性下降，且萌發后自身恢復生長的能力大大減弱［29］。

3.3 菌根真菌對鐵皮石斛輻射種子萌發和成苗的影響

在誘變育種中，通過調整培養條件提高突變細胞的競爭力，可獲得穩定突變株［30］。盧敏［31］發現有益真菌的侵染可增強石斛組培苗的耐熱性，提高其半致死溫度。本研究探討了膠膜菌屬菌根真菌在鐵皮石斛輻射種子萌發中的作用，發現與菌株JL2 共生萌發的輻射種子半致死劑量（69 Gy）較1/2MS 培養基對照組提高了7 Gy；另一方面，經高劑量（＞60 Gy）處理的種子與菌株JL2、JL4 共生萌發后可獲得更多的誘變幼苗，表明菌株JL2 和JL4 對輻射處理后種子的生長具有一定的恢復作用。這與其他研究者關于內生真菌和叢枝菌根真菌通過侵染植物形成共生體以增強宿主在逆境條件下生存能力的報道相一致［32］。同時也表明，今后可通過與適宜真菌菌株共生培養，來提高鐵皮石斛誘變材料在后期生長中的恢復能力和成活率。

4 結論

共生與非共生培養下，鐵皮石斛種子萌發率隨輻射劑量的增加呈下降趨勢，較高劑量對幼苗形成有抑制作用，20 Gy 處理可促進鐵皮石斛種子快速成苗，為縮短育種周期、快速擴繁提供技術參考。菌株JL2 和JL4 可在一定程度上提高鐵皮石斛種子的輻射耐受能力，恢復輻射處理種子的生長分化能力。高劑量（90、120 Gy）輻射的種子與JL4 共生萌發可獲得表型變化更明顯的幼苗。蘭科植物種子細小且數量多，因此為獲得表型變化明顯的突變株，可適當提高輻射劑量，并對輻射種子進行菌根真菌共生萌發培養。