低溫脅迫下外源SA對釀酒葡萄幼苗抗氧化酶活性及內源SA含量的影響

王旺田，李 斌，趙俊鵬，王寶強，張 芮

(1. 甘肅省干旱生境作物學重點實驗室，甘肅農業大學生命科學技術學院，甘肅 蘭州 730070；2. 甘肅省科學院生物研究所，甘肅 蘭州 730099；3. 莊浪縣自然資源局，甘肅 莊浪 744600；4.甘肅農業大學水利水電工程學院，甘肅 蘭州 730070)

低溫是限制植物生長發育和地理分布的主要環境因子，但是植物經過長期適應多變的環境溫度已經進化出一系列生理和分子機制來抵御低溫造成的傷害，例如通過低溫馴化過程產生相應的反應，提高自身的耐冷性[1]。當遭受低溫脅迫時，植物體內積累大量的活性氧(ROS)，通過啟動自身的抗氧化防御系統，清除體內過多的ROS物質[2]，保護正常的生理代謝[3-4]。植物抗氧化防御系統主要包含抗氧化酶類和非酶類物質。為了減輕低溫脅迫引起的水分脅迫和滲透脅迫，植物有時還會顯著增加體內的滲透物質積累，對低溫信號產生應答，維持細胞穩態及正常生理代謝，從而提高自身的耐冷性及耐寒性[5-8]。

葡萄(VitisviniferaL.)是多年生落葉藤本植物，具有重要的經濟價值、營養價值和藥用價值，在世界上具有悠久的種植歷史[9]。目前我國釀酒葡萄主產區為冬季氣候嚴寒干燥、全年降水較少的北方地區，而主要栽種釀酒葡萄品種是原產于西亞和地中海地區的歐亞種[10]，因此低溫成為限制釀酒葡萄種植面積擴大的主要因素之一[11]。低溫除了影響葡萄細胞膜的穩定性，還會改變保護酶活性和內源物質的含量[12-13]。近年來有大量報道表明激素參與了植物對低溫的響應，調控植物在低溫下的營養生長、生殖和發育，改善其在多種逆境下遭受的破壞[14-15]。植物激素水楊酸(Salicylic acid, SA)在植物體內分布廣泛，被認為是直接或間接影響植物對生物及非生物抗性的信號分子，參與植物對干旱、寒冷和高溫等非生物脅迫的防御反應。在植物與生物及非生物脅迫的相互應答中，外源SA的應用是否也起到關鍵性作用？這個問題逐漸成為研究熱點。有研究發現SA及其衍生物處理能通過增強抗氧化酶活性來提高鐵皮石斛及椰子在不同程度低溫下的抗寒性；同時，適當濃度的外源SA能夠誘導苗期植物的冷敏感度降低，使植株耐寒性得到增強[16-17]。研究也發現在不同環境條件下應用高濃度的外源SA會產生不良后果，例如常溫下高濃度外源SA的噴施處理會導致玉米幼苗的各光合特征值顯著降低，并對幼苗的生長產生不可逆的破壞[18]。所以，外源SA的應用能否對植物產生有利的影響，與植物品種以及環境因素有關。

因此，通過分析低溫脅迫下外源SA影響植物內源SA含量的變化來揭示SA響應低溫脅迫機制有重要意義。本試驗選擇煉苗存活率高、低溫下穩定性強且應用廣泛的釀酒葡萄砧木品種‘貝達’，研究低溫脅迫下葡萄幼苗內源SA含量、抗氧化物酶活性以及MDA等生理指標的變化，并分析外源SA處理與低溫逆境下葡萄幼苗葉片抗氧化酶與內源SA含量間的應答關系，以期為水楊酸在葡萄逆境脅迫研究機理和應用方面提供一定的試驗依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料和試驗處理

試驗在甘肅農業大學生命科學技術學院生物質能實驗室進行，采用多因素試驗設計。試驗材料‘貝達’(Vitisriparia×V.labrusca，Beta)外植體由甘肅省干旱生境作物學重點實驗室提供。SA(購自上海源葉科技有限公司)用蒸餾水配制成100 mmol·L-1的母液，4℃保存，試驗時根據需要進行稀釋。

2021年10月25日利用植物組織培養技術(圖1)，選用GS培養基離體培養葡萄幼苗30 d(培養條件：溫度25℃；濕度65%；光照強度8 000 lx；16 h光照，8 h黑暗)后，挑選生長至6～10片葉子的幼苗進行煉苗，隨后移入注有Hoagland營養液的培養盆(10 cm×10 cm×9 cm)內，并用泡沫板固定，置于人工氣候培養箱中培育至泡沫板固定處葡萄苗直徑達0.8 cm以上備用。

圖1 植物組織培養技術獲取的試驗材料Fig.1 Plant tissue culture technique to obtain experimental materials

組培苗煉苗、水培試驗完成后，設置2組試驗，第1組為低溫脅迫試驗，第2組為低溫脅迫與外源SA噴施組合試驗。其中第1組低溫脅迫試驗于2021年12月15日開始，選取培養盆中生長一致的幼苗分別轉移到溫度為4℃和12℃的培養箱進行低溫脅迫，以常溫(25℃)為對照，共3個處理，每個處理設置3次重復，每個重復10株葡萄幼苗。低溫培養4 d后進行常溫4 d的恢復生長，分別標記為低溫脅迫階段和恢復生長階段，在低溫脅迫0 d(T)、低溫脅迫第4天(T1)和恢復常溫生長第4天(T2)分別釆集葡萄幼苗頂端第3片幼嫩葉片，液氮冷凍后儲存在-80℃冰箱備用。

第2組低溫與外源SA噴施組合試驗于2021年12月25日開始，用手搖噴霧器對葡萄幼苗進行外源SA噴施處理，噴施濃度分別為0、0.5、1.0 mmol·L-1，直到葉面噴施液滴開始脫落為止，每個處理3個重復，每個重復10株葡萄。在外源SA處理后，將幼苗轉移到人工氣候室(培養條件同上)，在4℃下處理4 d。分別于第0、2、4天對幼苗頂端第3片葉進行取樣，樣品置于液氮冷凍后儲存在-80℃冰箱，后續進行抗氧化酶活性的測定，對抗氧化酶活性影響最大的對應SA處理低溫脅迫第4天的樣品進行內源SA濃度的測定。

1.2 試驗方法

葉片細胞膜穩定性通過測定電導率，用膜穩定指數來衡量[14]；CAT、SOD、POD活性及MDA含量均使用生化試劑盒(購自北京索萊寶科技有限公司，貨號分別為BC0200、BC0170、BC0090、BC0020)測定。內源SA含量的測定采用酶聯免疫吸附 (ELISA)試劑盒(購自上海酶聯生物科技有限公司，貨號為ml077224)，具體步驟參考試劑盒說明書。

1.3 統計分析

采用IBM-SPSS 23.0統計軟件和Excel 2016軟件對各參數進行綜合分析和繪圖。對不同低溫脅迫程度下的葡萄幼苗內源SA與保護酶活性及膜的損傷進行逐步回歸分析，并得到回歸方程，所有比較均在95%的概率水平上進行(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫對釀酒葡萄幼苗葉片細胞膜穩定性和MDA含量的影響

植物遭受逆境時，細胞膜的穩定性會發生顯著變化。如圖2A所示，不同處理在常溫(25℃)下生長的葡萄幼苗膜穩定指數無明顯變化。與常溫相比，12℃低溫脅迫處理顯著增加了釀酒葡萄幼苗葉片膜穩定指數，然而4℃低溫脅迫處理顯著降低了葉片膜穩定指數，并顯著低于12℃處理。低溫脅迫后的幼苗轉移至25℃恢復生長4 d后(第8天)，膜穩定指數無明顯變化，4℃處理的幼苗膜穩定指數最小，12℃處理的膜穩定指數仍高于常溫對照，說明適宜低溫增強了膜的穩定性。

如圖2B所示，從低溫脅迫前、低溫脅迫4d到恢復生長4d，常溫條件(25℃)下生長的釀酒葡萄幼苗葉片丙二醛(MDA)含量變化不顯著。在低溫脅迫后，釀酒葡萄幼苗葉片MDA的含量顯著增加，說明低溫造成膜的損傷。此外，經4℃低溫脅迫處理的幼苗MDA含量高于12℃下的含量。低溫脅迫后的幼苗轉移至25℃恢復生長4 d后(第8天)，各溫度下MDA的含量均降低，4℃處理的幼苗MDA含量顯著降低，但仍高于常溫對照及12℃的MDA含量，恢復生長后在25℃、12℃和4℃處理之間MDA含量差異不顯著。

注：T為低溫脅迫0 d，T1為低溫脅迫第4天，T2為恢復常溫生長第4天。不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05 )。下同。Note: T is before low temperature treatment, T1 is the 4th day of low temperature stress, T2 is the 4th day after returning to normal temperature.Different letters mean significant difference by Duncan’s multiple range test (P<0.05). The same below.圖2 低溫脅迫對釀酒葡萄幼苗細胞膜穩定性和MDA含量的影響Fig.2 Effect of low temperature stress on membrane stabilityand MDA content of wine grape seedlings

2.2 低溫脅迫對釀酒葡萄幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

抗氧化酶具有將體內過氧化物轉換為毒害較低或無害物質的功能。如圖3A所示，低溫脅迫后和恢復生長4 d后，常溫條件下釀酒葡萄幼苗葉片的SOD活性無明顯變化，但顯著高于低溫處理前葉片的SOD活性。低溫脅迫均提高了釀酒葡萄幼苗葉片SOD活性，但低溫脅迫程度不同，葉片SOD活性的增加程度也不同。經低溫4℃處理的葡萄幼苗SOD活性顯著高于12℃處理。恢復生長4d后(第8天)，經過低溫處理的葡萄幼苗葉片SOD活性均有所降低，與12℃低溫相比，4℃低溫脅迫處理的幼苗SOD活性較高，而4℃和12℃處理的幼苗SOD活性顯著高于常溫生長8 d處理，說明低溫程度加劇會誘導更高水平的SOD。

如圖3B所示，與低溫處理0d相比，低溫脅迫4d后和恢復生長4d后常溫條件下生長的釀酒葡萄幼苗葉片的POD活性差異不顯著。低溫脅迫4d增加了葉片的POD活性，并且其活性隨著低溫程度的加劇而增加，但4℃和12℃低溫脅迫處理間POD活性差異不顯著。恢復生長4d后(第8天)，經過低溫脅迫處理的葡萄幼苗葉片POD活性均有所降低，4℃低溫脅迫處理的幼苗POD活性仍略高于12℃處理，經低溫脅迫后的所有幼苗的POD活性均低于對照組。

圖3 低溫脅迫對釀酒葡萄幼苗抗氧化酶活性和內源水楊酸含量的影響Fig.3 Effect of low temperature stress on antioxidant enzymes activity and endogenous salicylic acid content of wine grape seedlings

如圖3C所示，常溫條件下生長的釀酒葡萄幼苗葉片的CAT活性無明顯變化，同POD活性變化趨勢一致。低溫脅迫均提高了釀酒葡萄幼苗葉片CAT活性，但低溫脅迫程度不同，葉片CAT活性的增加幅度也不同，經4℃低溫處理的葡萄幼苗的CAT活性明顯高于12℃處理，12℃處理與常溫處理之間CAT活性差異不顯著。恢復生長4 d后(第8天)，經過4℃低溫處理的葡萄幼苗葉片CAT活性降低，而12℃處理的葡萄幼苗葉片CAT活性增加，但同低溫脅迫后CAT活性相比差異不顯著。低溫脅迫處理后和恢復生長4 d后，4℃低溫脅迫處理的幼苗CAT活性較12℃低溫高，顯著高于常溫生長8 d下的CAT活性，12℃處理幼苗CAT活性也高于對照組，但差異不顯著。這說明不同的低溫會誘導不同程度CAT的積累。

2.3 低溫脅迫對釀酒葡萄幼苗葉片內源水楊酸含量的影響

如圖3D所示，與低溫處理前相比，常溫條件(25℃，CK)下生長4 d和8 d后的釀酒葡萄幼苗葉片SA含量有所增加，但是差異不顯著。低溫脅迫顯著增加了釀酒葡萄幼苗葉片SA的含量，經4℃低溫脅迫處理的幼苗SA含量顯著高于12℃處理的含量。低溫脅迫處理的幼苗轉移至25℃恢復生長4 d后(T2)，SA的含量相對于低溫脅迫階段均顯著降低，但仍高于常溫對照。

2.4 低溫脅迫下葡萄幼苗葉片各生理指標的相關性及回歸分析

在不同程度的低溫脅迫處理后，6項抗寒指標兩兩相關性分析表明(表1)，SA與MDA、POD、SOD、CAT均呈極顯著正相關(P<0.01)。MDA與膜穩定指數負相關，與POD、SOD、CAT均呈極顯著正相關(P<0.01)。膜穩定指數與CAT顯著負相關(P<0.05)，與SA、SOD、POD呈負相關但不顯著(P>0.05)。其他指標之間的相關性大部分達到極顯著(P<0.01)或顯著正相關關系。MDA含量、SOD、CAT、POD活性與內源SA含量的回歸方程如表2所示，MDA含量、SOD、CAT、POD活性與內源SA含量之間存在線性回歸關系，保護酶活性受內源SA和低溫信號的共同調控。

表1 葡萄葉片低溫脅迫處理后各生理指標間相關系數Table 1 Correlation coefficients among the physiological indicators of grapevine leaves after low temperature stress treatment

表2 低溫脅迫下葡萄幼苗葉片內源SA含量與MDA、抗氧化酶活性間的逐步回歸分析Table 2 Stepwise regression analysis between endogenous SA content and MDA and antioxidant enzyme activities in leaves of grape seedlings at low temperature

2.5 外源水楊酸處理對低溫下葡萄幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

如圖4A、4B、4C所示，在葡萄幼苗葉片噴施0.5、1.0 mmol·L-1濃度的外源SA后，低溫脅迫導致葡萄幼苗葉片中SOD、POD和CAT活性較對照顯著增加。隨著外源SA濃度的增加及低溫脅迫持續時間的延長，SOD、POD和CAT活性增加，在外源SA濃度為1.0 mmol·L-1時SOD、POD和CAT活性最強。溫度、外源SA及兩者的交互作用對POD和SOD活性產生了極顯著的影響(P<0.001)，兩者交互作用對CAT活性影響不顯著(表3)。常溫條件下噴施外源SA促進SOD、POD和CAT活性增加，但SOD活性在外源SA濃度為0.5 mmol·L-1與1.0 mmol·L-1之間差異不顯著，與0 mmol·L-1SA濃度處理差異顯著(圖4A)，POD和CAT活性在對照、不同SA濃度之間(常溫)差異不顯著(圖4B、4C)。

表3 溫度處理、外源SA及其交互作用對抗氧化酶活性影響的顯著性分析Table 3 Significance analysis of temperature, exogenous salicylic acid and their interactions on antioxidant enzyme activity

低溫脅迫處理2 d 和4 d，SOD和POD活性在不同濃度SA之間差異顯著(圖4A、4B),而低溫脅迫處理2 d時CAT活性在SA濃度為0.5 mmol·L-1與1.0 mmol·L-1間差異不顯著；低溫脅迫處理4 d時 CAT活性增加，在SA濃度為0.5 mmol·L-1與1.0 mmol·L-1之間差異不顯著(圖4C)。低溫脅迫4 d時，SOD、POD、CAT活性在SA濃度為1.0 mmol·L-1時比對照分別增加127.63%、190.00%和173.53%，而在SA濃度為0 mmol·L-1時比對照在低溫脅迫4 d后SOD、POD、CAT活性分別增加102.88%、60.00%和137.5%，說明外源SA調控SOD、POD、CAT活性響應低溫脅迫，其中POD活性增加最多。

2.6 外源水楊酸處理對低溫下葡萄幼苗葉片內源水楊酸含量的影響

如圖4D所示，在常溫及低溫條件(4℃)下噴施外源SA均增加了內源SA的含量。在對照組和外源SA處理組，低溫脅迫顯著增加了釀酒葡萄幼苗葉片內源SA含量，與常溫處理相比，對照內源SA含量顯著增加53.11%，外源SA處理顯著增加80.36%。常溫條件下外源SA處理比對照顯著增加18.97%，而低溫條件下SA處理組比對照組顯著增加40.14%。說明在低溫脅迫下外源SA處理更能促進內源SA積累。

圖4 SA處理對低溫下葡萄幼苗葉片抗氧化酶活性及內源SA含量的影響Fig.4 Effect of SA treatment on antioxidant enzyme activity and endogenous salicylic acid content of grape seedling leaves at low temperature

3 討 論

低溫是限制葡萄種植面積擴大的主要因素之一，由于北方冬季極端低溫和春季冷害頻發造成我國葡萄種植巨大的經濟損失[19]。植物的抗寒能力可以通過不同的生理機制得到增強，其中抗氧化酶活性水平很大程度上影響植物對低溫的耐受性，這些保護酶例如SOD、POD、CAT等能夠通過調節逆境條件下植株體內產生的活性氧水平使其達到正常的平衡狀態，進而增強植物抗寒性[20]。此外，活躍在植物體內微量的小分子物質也能誘導植物的耐受性，大量研究表明，外源SA可以誘導植物產生系統獲得性抗性，同時還能誘導植物對非生物脅迫的抗性[21-22]。本試驗通過研究不同程度低溫對釀酒葡萄幼苗內源SA、MDA含量、保護酶活性以及細胞膜穩定性的影響，發現不同程度的低溫均會誘導葡萄幼苗葉片細胞膜氧化程度加劇，膜穩定性減弱，抗氧化酶活性和內源SA含量逐漸積累。

MDA和膜穩定指數能夠反映低溫造成細胞膜完整性破壞的程度[23]。本研究發現低溫逆境明顯加劇了釀酒葡萄幼苗葉片細胞膜氧化程度，這與前人的研究結果基本一致[24]。此外低溫脅迫程度越高，MDA的含量越多，細胞膜穩定指數下降越顯著，這說明低溫程度越高，細胞膜氧化損傷越大。植物體自身的抗氧化清除系統能夠減緩非生物脅迫的危害，這是因為在低溫信號的影響下，植物自身會積累超過穩態平衡的活性氧物質，對其生理產生極其嚴重的損害，此刻植物迅速提高抗氧化酶活性來清除過多的活性氧，但這種調節程度并不是無限制的[21]。本試驗中葡萄幼苗在遇到低溫脅迫時抗氧化酶SOD、POD、CAT活性顯著提高，低溫脅迫水平不同變化趨勢也不一致，溫度越低時酶活性就越高。植株恢復生長后抗氧化酶活性仍高于對照，表明這些保護酶活性受低溫的調控，同時在保護植物生長過程中可能發揮了持續性的作用。本研究發現，低溫下葡萄幼苗葉片的SA含量顯著增加，低溫水平越高，SA含量增加越顯著。而在幼苗恢復生長時 SA含量顯著大于對照，由此表明低溫逆境可能會調控葡萄植株體內SA的生物合成，這與李亮等[25]對黃瓜的研究結果基本一致。

葉片上噴施SA顯著提高了SOD、POD、CAT活性和內源SA含量。當SA濃度較低時，植物體內氧化和抗氧化作用會短期失衡，從而提高自身的抗氧化能力[26-28]。激素SA是植物線粒體介導的防御信號和程序性細胞死亡(PCD)的關鍵調節因子，調節植物線粒體活性氧代謝。植物遭受病原菌侵染時，SA參與一系列細胞防御以及非生物脅迫反應，其內源SA含量受到多種因素的調節。在本研究中，低溫和外源SA均誘導內源SA的積累，而低溫脅迫條件下內源SA與POD、SOD和CAT活性呈正相關，通過提高POD、SOD和CAT的活性來減輕低溫脅迫對植物的不利影響，這表明SA通過減少ROS的積累和提高抗氧化酶的活性來影響植物的抗性，使它們能夠在低溫條件下生存。而外源施用SA引起的內源SA調控植物減緩低溫脅迫對葡萄幼苗生長及生理的損傷，提高其抗寒能力還需從葉片微觀形態特征、光合作用、滲透調節及內源激素、轉錄組學測序技術等方面進行后續的深入研究，分析SA信號與低溫信號相關聯共同調控葡萄抗逆性，揭示SA調控植物抗寒性的分子機制，并與大田試驗相結合，細化外源SA噴施時間和噴施方式，確定最佳噴施方案，將是今后北方地區耐寒釀酒葡萄品種精準篩選和科學田間管理的重要研究領域和手段。

4 結 論

低溫影響植物正常的生長和生理過程，并引起冷害和植物的死亡。本研究中不同程度低溫脅迫導致葡萄幼苗葉片細胞膜穩定性下降，膜的氧化損傷加劇，誘導幼苗葉片抗氧化酶SOD、POD、CAT活性顯著增加，內源SA含量積累；抗氧化酶活性和內源SA含量變化受低溫脅迫水平的調節，在一定溫度范圍內，低溫脅迫程度越大，幼苗葉片POD、SOD、CAT活性、內源SA含量增加越多。1 mmol·L-1外源性 SA是緩解低溫脅迫影響的較佳噴施濃度，外源性SA的應用明顯增加了低溫下葡萄葉片的SOD、CAT和POD活性和內源SA的積累，有效減輕了低溫脅迫對葡萄幼苗傷害。結合低溫脅迫及外源SA對抗氧化酶SOD、POD、CAT活性及內源SA含量的影響，本研究認為低溫脅迫及外源SA誘導植物積累更多的內源SA調控保護酶活性，SA在葡萄低溫脅迫中發揮協同作用，降低ROS對細胞膜的傷害，提高葡萄對低溫脅迫的耐受性。