不同種子處理方法下長枝木霉T6菌株對小油菜促生作用及生理特性的影響

郭彩蘋，張 祿，孫晨曦，馬耀杰，李昕冉，景 濤，徐秉良，張樹武

(甘肅農業大學植物保護學院，甘肅省農作物病蟲害生物防治工程實驗室，甘肅 蘭州 730070)

小油菜(BrassicachinensisL.)又名上海青、青梗菜和青菜等[1]，由于其具有口感爽脆、富含維生素、生長周期短及一年四季皆可種植等優點[2]，已成為我國種植面積和范圍最廣的蔬菜之一[3]。但是近年來小油菜種植模式單一、化學肥料使用種類單一及其過量使用[4]，導致連作障礙、土壤板結和酸化等一系列問題[5]，使得種子發芽率降低，幼苗生長勢降低，甚至嚴重影響小油菜口感和品質。因此，如何提高種子發芽率、幼苗生長勢及育苗效率等成為目前種植小油菜急需解決的問題。

木霉菌(Trichodermaspp.)是一類廣泛存在于各個生態系統中的真菌[6]，其不僅具有重要的生防價值，還具有促進植物生長、改善植物生長環境、提高植物產量及其產品質量等功能[7]。賀字典等[8]研究表明，溶磷木霉菌tang-10-11能夠將辣椒根際土壤難溶性磷轉化成速效性磷，間接促進速效鉀和有機質的轉化，進而促進了辣椒植株生長，提高辣椒維生素C和可溶性糖含量；張成等[9]發現棘孢木霉DQ-1分生孢子粉能夠顯著促進黃瓜、辣椒、番茄和西瓜幼苗根系數量增多和莖稈增粗；廉華等[10]發現棘孢木霉菌劑能夠提高黃瓜幼苗葉綠素含量、根系活力、可溶性糖及可溶性蛋白等含量，進而提高黃瓜產量和品質；Yu 等[11]發現木霉菌株TaspHu1高濃度孢子懸浮液可以顯著提高番茄株高、莖粗、可溶性蛋白和可溶性糖的含量。但是，目前有關采用水瓊脂培養法、種子浸泡法和盆栽灌根法處理測定長枝木霉T6菌株對小油菜促生作用及生理特性影響方面的報道較少。

因此，本試驗通過種子萌發和幼苗盆栽試驗測定了長枝木霉T6菌株孢子懸浮液和發酵濾液對小油菜促生作用及生理特性的影響，分析和討論長枝木霉T6菌株對小油菜的促生效果及初步作用機制，以期為提高小油菜產量和品質提供理論和實踐參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 供試菌株 供試菌株為長枝木霉T6菌株，由甘肅農業大學植物保護學院植物病理學實驗室提供，保藏于中國科學院微生物研究所，保藏號為CGMCC No.13183。

1.1.2 供試品種 小油菜品種為‘德高’，采購于甘肅省農業科學院種子有限責任公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 長枝木霉T6菌株分生孢子懸浮液配制 懸浮液參照張樹武等[12]方法配制。長枝木霉T6菌株在PDA平板培養6 d后，在其培養基中加入1滴Tween-80和5 mL無菌水配制成分生孢子懸浮液，并將其轉移到無菌離心管中，經振蕩充分混勻后，利用血球計數板計算其濃度，最終配制濃度為1.0×107cfu·mL-1孢子懸浮液備用。

1.2.2 長枝木霉T6菌株發酵濾液制備 取1 mL濃度為1.0×107cfu·mL-1長枝木霉T6菌株孢子懸浮液加入到70 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基中，同時取1 mL無菌水加入到70 mL馬鈴薯葡萄糖液體培養基中作為對照。將兩者置于溫度為25℃，轉速為150 r·min-1的搖床中培養；8 d后，將培養液經8 000 r·min-1離心20 min后吸取上清液，并利用雙層濾膜過濾，加入懸浮液處理獲得的濾液即為長枝木霉T6菌株發酵濾液。每個處理和對照均重復6次。

1.2.3 長枝木霉T6菌株及其孢子懸浮液對小油菜種子活性及幼苗生長的影響 水瓊脂培養法：挑選飽滿健康的小油菜種子，利用75%酒精浸泡消毒2 min后，經無菌水充分沖洗3次，用無菌吸水紙吸取多余水分后備用。將其種植于水瓊脂培養基一側1/3處(d=8.5 cm)，并在其對應的另一側1/3處接種直徑為0.5 cm長枝木霉T6菌株菌餅和空白水瓊脂菌餅分別作為處理和對照。待接種后，將其分別置于25℃培養箱中光暗交替培養(16 h/8 h)。每個培養基中種植5粒小油菜種子，每個處理和對照均重復6次。

浸泡法：將消毒后的種子分別置于濃度為1.0×107cfu·mL-1長枝木霉T6孢子懸浮液和無菌水中浸泡2 h，分別作為處理和對照。然后，分別將處理和對照組種子置于含有一層紗布和兩層濾紙的無菌培養皿(d=8.5 cm)中，并置于25℃培養箱中光暗交替培養(16 h/8 h)。每個培養皿中種植5粒小油菜種子，每個處理和對照均重復6次。

待小油菜種子胚根長度超過種子長度一半時開始統計發芽率和發芽指數，待處理7 d后測定幼苗胚根和胚芽長度及干、鮮重，并利用根系掃描儀(WinRHIZO pro LA2400)測定根系總投影面積、總根表面積、平均根系直徑、總根體積和根尖數。每個處理和對照均重復6次。

發芽率(%)=(發芽種子總數/供試種子總數)×100

發芽指數=∑Gt/Dt

式中，Gt為t時間內發芽數,Dt為相應發芽天數。

1.2.4 長枝木霉T6菌株發酵濾液對小油菜幼苗生理特性的影響 將飽滿、健康且經消毒的小油菜種子種植于含有營養土的育苗盤中(32穴)，每穴種植5粒。種植10 d后，取20 mL長枝木霉T6菌株發酵濾液澆灌于小油菜根系周圍土壤中，對照則澆灌等體積馬鈴薯葡萄糖濾液，每個處理和對照均重復6次。然后，將其置于溫室中培養(培養溫度25℃，相對濕度RH>60%和光照16 h/8 h)，每隔2 d澆一次水，并在處理30 d后分別測定小油菜幼苗葉綠素和可溶性蛋白含量。參考陳毓荃[13]方法，采用分光光度法測定小油菜幼苗葉綠素含量；參考楊玉芳[14]和邱葵等[15]方法，采用考馬斯亮藍G-250法測定小油菜幼苗可溶性蛋白含量。每個處理及對照均重復3次。

1.3 數據處理

采用Excel 2010軟件和SPSS 21.0軟件整理分析數據，采用Duncan’s新復極差法對各處理進行多重比較(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 水瓊脂培養下長枝木霉T6菌株對小油菜種子活性的影響

在水瓊脂培養基上，長枝木霉T6菌株對小油菜種子活性具有顯著的影響 (圖1，表1)。經長枝木霉T6菌株處理的小油菜種子發芽整齊，幼苗生長發育良好，胚根長且粗壯(圖1B)，而對照生長勢相對較弱，胚根較短(圖1A)。與對照相比，長枝木霉T6菌株處理后的小油菜種子發芽率、發芽指數、幼苗胚根長度、胚芽長度、鮮重和干重的相對增長率分別為2.51%、20.55%、70.79%、21.98%、32.00%和30.00%(表1)。

注：A：對照；B：長枝木霉T6菌株處理。Note: A: control; B: Trichoderma longibrachiatum T6 strain treatment.圖1 長枝木霉T6菌株對小油菜幼苗生長的影響Fig.1 Effect of Trichoderma longibrachiatum T6 strain on the seedling of Brassica chinensis growth

表1 長枝木霉T6菌株對小油菜種子活性及幼苗形態特征的影響Table 1 Effect of Trichoderma longibrachiatum T6 strain on the seed vigor and seedlings morphological characteristics of Brassica chinensis

2.2 水瓊脂培養下長枝木霉T6菌株對小油菜根系發育的影響

與對照相比，長枝木霉T6菌株能夠顯著促進小油菜根系生長發育(圖2，表2)。經長枝木霉T6菌株處理的小油菜胚根發育良好，側根數量多且發達(圖2B)，而對照側根數量相對較少(圖2A)。長枝木霉T6菌株處理的幼苗根系總投影面積、總根表面積、平均根系直徑、總根體積和根尖數顯著高于對照，分別較對照增加58.49%、58.79%、18.18%、100.00%和77.88%(表2)。

注：A：對照；B：長枝木霉T6菌株處理。Note: A: control; B: Trichoderma longibrachiatum T6 strain treatment.圖2 長枝木霉T6菌株對小油菜根系生長發育的影響Fig.2 Effects of Trichoderma longibrachiatum T6 strain on the root growth and development of Brassica chinensis

表2 長枝木霉T6菌株對小油菜單株根系生長發育的影響Table 2 Effect of Trichoderma longibrachiatum T6 strain on the root growth and development of Brassica chinensis

2.3 浸泡處理下長枝木霉T6菌株孢子懸浮液對小油菜種子活性的影響

經長枝木霉T6菌株孢子懸浮液浸泡處理的小油菜種子發芽速率和幼苗生長速率顯著增加，并且處理后其幼苗生長健壯，胚芽和胚根長且粗壯(圖3B)，而對照生長勢相對較弱，根系較短且側根較少(圖3A)。與對照相比，經長枝木霉T6菌株孢子懸浮液浸泡處理的種子發芽率、發芽指數、幼苗胚根長度、胚芽長度、鮮重和干重的相對增長率分別為2.06%、19.60%、82.21%、43.36%、31.58%和40.00%(表3)。

注：A：對照；B：長枝木霉T6菌株孢子懸浮液處理。Note: A: control; B: Trichoderma longibrachiatum T6 spore suspension treatment. 圖3 長枝木霉T6菌株孢子懸浮液對小油菜幼苗生長的影響Fig.3 Effect of the spore suspension of Trichoderma longibrachiatum T6 on the seedling of Brassica chinensis growth

表3 長枝木霉T6孢子懸浮液對小油菜種子活性及幼苗形態特征的影響Table 3 Effects of the spore suspension of Trichoderma longibrachiatum T6 on the seed vigor and seedlings morphological characteristics of Brassica chinensis

2.4 浸泡處理下長枝木霉T6菌株孢子懸浮液對小油菜根系發育的影響

與對照相比，經長枝木霉T6菌株孢子懸浮液浸泡處理的小油菜胚根發育良好，側根數量多且發達(圖4B)，而對照側根數量相對較少且較短(圖4A)。長枝木霉T6菌株孢子懸浮液浸泡處理后，小油菜根系總投影面積、總根表面積、平均根系直徑、總根體積和根尖數較對照分別增加44.19%、45.52%、13.04%、100.00%和28.57%(表4)。

注：A：對照；B：長枝木霉T6菌株孢子懸浮液處理。Note: A: control; B: Trichoderma longibrachiatum T6 spore suspension treatment.圖4 長枝木霉T6菌株孢子懸浮液對小油菜根系生長發育的影響Fig.4 Effects of the spore suspension of Trichoderma longibrachiatum T6 on the root growth and development of Brassica chinensis

表4 長枝木霉T6孢子懸浮液對小油菜單株根系生長發育的影響Table 4 Effects of the spore suspension of Trichoderma longibrachiatum T6 on the root growth and development of Brassica chinensis

2.5 長枝木霉T6菌株發酵濾液對小油菜幼苗葉綠素和可溶性蛋白質含量的影響

結果表明，長枝木霉T6菌株發酵濾液對小油菜幼苗葉綠素和可溶性蛋白含量具有顯著的影響。

經長枝木霉T6菌株發酵濾液處理30 d后，小油菜幼苗葉綠素和可溶性蛋白含量均顯著增加，與對照相比，其葉綠素和可溶性蛋白含量的相對增長率分別為31.95%和11.40%(表5)。

表5 長枝木霉T6菌株發酵濾液對小油菜幼苗葉綠素和可溶性蛋白含量的影響Table 5 Effects of Trichoderma longibrachiatum T6 fermentation filtrate on the chlorophyll and soluble protein content of Brassica chinensis seedlings

3 討論與結論

前人關于利用木霉菌促進植物生長方面的相關研究，主要集中在利用其提高植物種子發芽率、幼苗形態特性、根系生長發育及幼苗生理生化酶活性等，如Zhao等[16]研究發現棘孢木霉Q1能增加黃瓜根系活性進而促進根系生長；Elkelish等[17]發現哈茨木霉能通過增強番茄葉綠素的合成和必需營養元素(氮、磷和鉀)的吸收，促進其生長；Martinez-Medina等[18]研究發現木霉菌通過調控激素水平來促進甜瓜幼苗的生長。本試驗通過不同種子處理方法下測定長枝木霉T6菌株對小油菜促生作用及生理特性的影響，發現長枝木霉T6菌株及其孢子懸浮液能夠顯著提高小油菜種子的活性，改善幼苗根系生長發育狀況。吳利民等[19]利用不同稀釋倍數木霉發酵液浸泡番茄種子10 d后，發現處理后番茄種子發芽率及植株生長速度顯著提高；劉連妹等[20]研究發現哈茨木霉處理后番茄幼苗的株高和根長均較對照增加，與本試驗結果基本一致。此外，本試驗發現長枝木霉T6菌孢子懸浮液對小油菜幼苗根系干重、胚芽長度和胚根長度促生作用優于水瓊脂培養法。

另外，有研究表明葉綠素和可溶性蛋白含量與植物幼苗的生長發育密切相關，并且可溶性蛋白可為植物種子萌發提供營養元素，是衡量種子活性的重要指標之一[21]。本試驗發現長枝木霉T6菌株發酵濾液可顯著提高小油菜幼苗葉綠素和可溶性蛋白含量。張樹武等[22]發現不同稀釋倍數深綠木霉發酵液均能夠提高黑麥草幼苗葉綠素、可溶性蛋白含量和與抗性相關酶的活性，進而促進其生長；王依純等[23]發現3種木霉(棘孢木霉、哈茨木霉和擬康氏木霉)對黃瓜幼苗葉綠素含量、根系活力和根系總吸收面積等具有顯著提高作用。

因此，本試驗發現2種處理方法(水瓊脂培養法和種子浸泡法)下長枝木霉T6菌株及其孢子懸浮液對小油菜種子活性和根系生長發育具有較強的促生作用，并且其發酵濾液對小油菜葉綠素和可溶性蛋白質含量具有顯著提高作用，但是有關不同處理方法下長枝木霉T6菌株對小油菜促生作用機制還有待進一步深入研究。