水稻短寬粒基因SWG1的圖位克隆

朱洪慧，李映姿，高遠卓，林泓，王成洋，晏紫儀，彭瀚平，李田野，熊茂，李云峰

水稻短寬粒基因的圖位克隆

朱洪慧，李映姿，高遠卓，林泓，王成洋，晏紫儀，彭瀚平，李田野，熊茂，李云峰

西南大學水稻研究所/西南大學農業科學研究院/轉基因植物與安全控制重慶市重點實驗室，重慶 400716

【】水稻產量由單位面積有效穗數、每穗粒數和粒重3個因素構成，其中，粒重主要由水稻的籽粒形態決定。篩選和鑒定新的粒型突變材料和基因，可為產量性狀的分子設計育種奠定基礎。【】在秈稻保持系西大1B（XD1B）的甲基磺酸乙酯（EMS）誘變群體中鑒定到一個短寬粒突變體（）；分析籽粒形態和其他農藝性狀，并對穎殼進行組織細胞學觀察分析；運用BSA法進行基因定位；通過遺傳互補試驗確定候選基因；采用qRT-PCR分析該基因的表達模式及其他粒型相關基因和細胞發育基因的表達水平。【】農藝性狀分析發現，與野生型相比，突變體粒長顯著降低，粒寬顯著增加，表現出短寬粒的表型；進一步組織和細胞學分析，發現突變體穎殼縱向細胞變短是粒長變短的主要原因，而粒寬增加是由于穎殼橫向細胞數目和細胞大小同時增加。遺傳分析結果表明，該突變性狀受隱性單基因控制，通過圖位克隆與遺傳互補驗證，確定候選基因為，編碼一個植物特異轉錄因子。qRT-PCR分析發現該基因表達無明顯的組織特異性，在莖、葉、幼穗中表達強烈。通過對已知粒型相關基因、細胞周期和細胞擴展相關基因進行分析，發現通過正向調控穎殼橫向細胞數目和（或）細胞大小決定粒寬的和在突變體中上調明顯，而正向調控縱向細胞數目和大小并負向調控橫向細胞數目和大小的/在突變體明顯下調；另外，部分與細胞周期和細胞擴展相關的基因也在突變體和野生型之間的表達也呈現顯著差異。【】編碼一個植物特異的轉錄因子，通過調控粒型基因（、和/等）影響穎殼的細胞增殖和細胞擴展，從而決定水稻籽粒長度和寬度。

水稻；籽粒形態；穎殼發育；圖位克隆

0 引言

【研究意義】水稻（L.）是重要的糧食作物，全球有一半的人口食用水稻，目前，中國水稻產量在全球排名第一。水稻產量由單位面積有效穗數、每穗粒數和粒重3個因素共同決定，其中，粒重主要受籽粒形態的影響。水稻成熟籽粒最外層由一層堅硬的穎殼（內稃和外稃）包裹；在雙受精前后，胚乳和胚開始發育之前，穎殼的細胞增殖和擴展已經完成，其大小形態已經確定；其后隨著內部胚乳和胚等組織器官的發育，穎殼進一步硅化、脫水、成熟，但其大小形態不會再發生變化；換言之，雖然主要營養物質胚乳是受精后才開始發育，但是，籽粒形態在很大程度上是由受精前穎殼的發育所決定。基于穎殼的重要性，水稻穎殼發育的遺傳機制研究對于改善粒型、提升產量具有重要的理論和應用價值。【前人研究進展】近年來，人們鑒定了許多與水稻粒型發育相關的基因，它們大多是通過影響穎殼細胞數目（細胞增殖）和（或）細胞大小（細胞擴展）來起作用[1-2]；按照調控途徑可以分為G蛋白信號、泛素蛋白酶體、MAPK信號通路、激素（BR、IAA和CK）信號和其他途徑；而按照基因具體功能，即對穎殼細胞增殖和細胞擴展的具體作用，也可以將目前已克隆的與穎殼發育相關粒型基因分為三類：第一類，、、/、/、、/等只影響穎殼細胞增殖的基因。其中，編碼異三聚體G蛋白中非典型的Gγ亞基，屬于G蛋白途徑，負向調控細胞增殖[3-5]。和/都屬于泛素蛋白酶體途徑，編碼一個環型E3泛素連接酶，負調節細胞的分裂，突變后增加了穎殼細胞的數目，最終粒寬和粒重增加[6-7]。/編碼一個泛素特異性蛋白酶，具有去泛素化活性，通過調控穎殼橫向細胞增殖來正向調控水稻籽粒寬度[8]。/編碼一個鈣調素結合蛋白，是BR激素信號傳導的正調控因子，通過影響穎殼的細胞數目來控制籽粒寬度和粒型[9-10]。同時，BR途徑的/編碼一個帶有Kelch重復域的蛋白磷酸酶OsPPKL1，通過去磷酸化抑制BR信號轉導和細胞周期蛋白Cyclin-T1;3活性，從而減少細胞分裂，抑制籽粒伸長[11-12]。屬于其他途徑，編碼一個植物特有的PLATZ轉錄因子，通過籽粒的細胞增殖，正向調控籽粒長度[13]。第二類，、、、、和等只影響細胞擴展的基因。其中，屬于泛素蛋白酶體途徑的編碼一個具有去泛素化酶活性的蛋白酶，通過影響穎殼細胞擴展來控制水稻籽粒的大小和形狀；功能缺失后粒寬和粒厚增加，粒長變短[14]，、和都與BR激素途徑相關，其中，、編碼細胞色素P450家族蛋白，是BR生物合成過程中的關鍵酶，通過調控細胞擴展影響穎殼的發育，正向調控籽粒大小，它們的多個功能缺失突變體都表現小粒，而過表達則增加籽粒長寬[15-18]，卵形家族蛋白OFP3是BR合成和信號傳導的抑制因子，負調控細胞伸長，過表達會導致籽粒變小[19]，和都參與生長素途徑，轉錄因子OsARF6受生長素信號調控，能直接與生長素輸入載體OsAUX3啟動子結合，正調控表達，通過改變穎殼細胞生長素的含量和分布、影響穎殼細胞的縱向伸長，進而負調控粒長和粒重[20]。第三類，、、/、、、/、/OsSPL16、SRS1/DEP2等基因可以同時影響穎殼細胞增殖和細胞擴展。其中，、、/與BR信號途徑相關。編碼一個絲氨酸羧肽酶，可以加強BR信號傳導，通過促進水稻穎殼細胞分裂和擴展正向調控籽粒寬度[21]。GS9轉錄活性受BR途徑OsGSK2蛋白的正調控，功能缺失突變體穎殼的縱向細胞長度增大而橫向細胞數量減少，導致籽粒細長[22]；模塊同時受BR信號途徑OsGSK2和下游轉錄因子OsBZR1的調控，/與通過互作促進細胞分裂和細胞膨大，正向調控籽粒大小[23-26]。編碼一個膜定位蛋白，參與調節生長素的轉運，是生長素響應和轉運的正調控因子，通過增加穎殼細胞增殖與擴展，正向調控籽粒大小[27]；編碼細胞數目調控因子OsCNR1，與調控細胞周期的KRP1蛋白互作，影響細胞增殖和細胞生長，負向調控水稻粒寬和粒重[28]。GL7/GW7編碼一個TONNEAU1募集基序蛋白，表達量上調能增加穎殼細胞的縱向細胞分裂并減少橫向細胞分裂。GW8編碼一個包含SBP結構域的轉錄因子OsSPL16，高表達時能促進細胞分裂和灌漿從而促進水稻粒寬增加和增產，進一步發現/OsSPL16直接與/GW7啟動子結合并抑制其表達，從而增加橫向細胞分裂，正向調控水稻粒寬[29-30]。編碼一個植物特有的轉錄因子，功能缺失突變體穎殼的縱向細胞變大且細胞數目增多，橫向細胞變寬，導致產生小圓粒表型[31-34]。【本研究切入點】通過穎殼發育影響水稻籽粒形態的基因數量龐大，它們位于多個調控途徑并且通過幾種不同的調控方式影響了穎殼發育過程中的細胞生長，進而決定最終籽粒的形態建成。然而，多數基因在籽粒長度和寬度上的影響是一致的，或僅僅調控其中一方面。目前，在籽粒形態的縱向和橫向方面進行相反的調控基因仍較少。【擬解決的關鍵問題】本研究發現一個水稻短寬粒突變體，命名為（），通過對突變體進行詳細的表型分析，明確的生物學功能；通過圖位克隆和表達模式分析等，確定的基本信息，同時了解其調控籽粒形態發育的機制，為利用該基因進行水稻籽粒形態

分子設計育種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

水稻突變體來源于秈稻保持系西大1B（XD1B）的EMS誘變群體，經過多代自交進行分離純化后，突變性狀穩定遺傳。選用正常不育系材料56S作母本，突變體作父本，兩者雜交后收獲F1種子，同年，在海南種植F1并收獲種子。第二年種植獲得F2群體，將F1、F2群體用于遺傳分析和定位。

1.2 形態與組織學分析

挑取野生型和突變體成熟期的籽粒，用掃描電鏡和體視鏡觀察表型并拍照。從和野生型處于抽穗期的花序中，選取開花前的小穗，置于酒精醋酸福爾馬林混合固定液（FAA，50%無水乙醇、0.9 mol·L-1的冰乙酸和3.7%甲醛）中浸泡48 h以上，固定材料的細胞形態；然后，依次用乙醇進行梯度脫水、二甲苯透明和浸蠟處理。石蠟包埋，切出10 μm厚的蠟帶。經預檢查、分段后轉移到涂抹多聚賴氨酸的載玻片上，經過展片、烘片后，進行番紅染色，并用中性樹脂封片。用光學顯微鏡NikonE600觀察制作好的石蠟切片。

1.3 統計分析

于2022年夏季水稻抽穗期與成熟期，隨機選取10株野生型和10株突變體，統計穗長、一次枝梗、二次枝梗、穗粒數、粒長、粒寬和粒重等農藝性狀。隨機選取野生型和突變體抽穗期10個小穗進行石蠟切片觀察，每張切片統計小穗穎殼橫向細胞數量與細胞面積。隨機選取野生型和突變體成熟期的10個籽粒進行掃描電鏡觀察，統計穎殼縱向細胞數量與細胞長度。差異顯著性均采用測驗。

1.4 分子標記定位及連鎖圖譜的構建

在56S/雜交構建的F2群體中選取突變單株作為定位群體，使用BSA法進行目標基因的定位。根據F2植株表型，分別選取10株正常單株和10株突變單株，剪取等量葉片，構建正常基因池和突變基因池。用CTAB法提取親本、基因池和定位群體單株的DNA。定位引物選用SSR引物（表1），由北京擎科生物科技有限公司合成。PCR反應體系為2.0 μL 10×PCR buffer、0.4 μL 2.5 mmol·L-1dNTPs、10.3 μL ddH2O、10 μmol·L-1前后引物各0.5 μL、1.0 μL模板DNA、0.3 μL 5 U·μL-1Taq酶。PCR程序為94℃ 5 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃1 min，35個循環；72℃10 min。PCR產物經聚丙烯凝膠電泳后觀察。將只呈現56S帶型的單株記為A，只呈現帶型的單株記為B，同時呈現雙親帶型的單株記為H，用重組子個數進行作圖，根據Gramene網站（http://www. gramene.org/）的水稻基因組信息構建物理圖譜。

1.5 候選基因的克隆分析

從Gramene網站（http://www.gramene.org/）查詢并下載注釋基因的序列，設計突變位點擴增引物（F：5′-CAATAACTGCCACGGCAGCAAAC-3′和R：5′-CCAAGCAGCTCATCTTCCAGTCT-3′）。分別以野生型和突變體DNA為模板擴增目標序列，由測序公司進行測序分析。用Vector NTI 10.5軟件中Align功能或Assemble功能查看并比對野生型和突變體之間序列找出突變基因及突變位點。使用Chromas2軟件查看測序峰圖。

1.6 遺傳互補驗證

設計擴增引物（-com-F1：5′-ATGACATGA TTACGAATTCATGCAGGGTAGATGAGTCTGATTA -3′和-com-R1：5′-GCTTGATCTCTTTTGGTTA TGTGGGTCAGTGCTGTTAAGAGCCC-3′；-com- F2：5′-GGGCTCTTAACAGCACTGACCCACATAAC CAAAAGAGATCAAGC-3′和-com-R1：5′- CGA CGGCCAGTGCCAAGCTTACAGGGAACCAACTAATCATCTG-3′），擴增序列、3 417 bp上游序列和60 bp下游序列（總長為11 327 bp），將酶切的pCAMBIA1300載體作為骨架，通過同源重組法構建互補載體，酶切位點為dⅢ和RⅠ。

表1 引物序列

將構建好的載體質粒以及突變體種子送至武漢伯遠公司進行遺傳轉化，獲得轉基因苗，先洗脫掉其根部的瓊脂糖，然后室內培養數日，移至大田。提取轉基因葉片的DNA，設計外源檢測引物（- com-detection-F：5′-TAAGCTGCCAGTTGAGCGTTTC C-3′和-com-detection-R：5′-CACTTTATGCTTC CGGCTCGTATG-3′）進行PCR鑒定，以鑒定該遺傳轉化是否成功。

1.7 RNA提取及qRT-PCR分析

利用RNA提取試劑盒（TIANGEN生物公司）提取野生型和突變體RNA，并反轉錄成cDNA。以水稻為內參基因，使用Vector NTI 10.5軟件設計引物（表1），用BIO-RAD CFX Connect Realtime Reaction System儀進行qRT-PCR，所得數據使用2-ΔΔCt法計算RQ與SD值，作圖，并用檢驗法進行差異顯著性分析。

2 結果

2.1 swg1突變體的表型分析

與野生型相比，突變體葉片直立，穗型直立，株型整體較為緊湊（圖1-A）。同時，突變體穗長顯著變短，比野生型短20%左右（圖1-B和圖1-E）；雖然一次枝梗數無明顯差異，但二次枝梗數顯著低于野生型；由于二次枝梗數的減少和穗長的變短，突變體的每穗粒數極顯著減少（圖1-F—H）。

相比穗型的變化，突變體在籽粒形態上的改變也極為明顯。首先，突變體籽粒的長度極顯著變短，比野生型短12.3%（圖1-C和圖1-K），但突變體籽粒寬度極顯著高于野生型9.4%（圖1-C和圖1-L）；所以，突變體粒型表現為團粒，籽粒長寬比僅為3.0，而野生型達到3.6。可能由于長寬的相反變化，最終導致野生型和突變體的粒重無明顯差異（圖1-I）。進一步去除穎殼，統計野生型與突變體的糙米性狀，發現突變體的糙米長極顯著短于野生型10%左右，糙米寬極顯著長于野生型8%左右，長寬比也極顯著降低，這與籽粒變化基本一致（圖1-D和圖1-N—P）。

2.2 swg1突變體穎殼的細胞學分析

為進一步探究突變體出現短寬粒性狀的原因，對突變體穎殼進行了細胞學分析。首先，通過掃描電鏡觀察分析了野生型和突變體外稃和內稃外表皮細胞特征和數量，發現野生型和突變體內外稃外表皮細胞均呈現典型的硅化特征（圖2-A和圖2-E），每個細胞上分布一個明顯的瘤狀突起，細胞縱向排列規則，橫向無明顯規律，野生型和突變體之間無明顯差異（圖2-B和圖2-F）；統計外稃外表皮縱向硅化細胞的總數量，發現與野生型相比并無明顯差異（圖2-I）；進一步統計相同縱向長度的細胞數量，發現突變體的細胞數量極顯著多于野生型，隨后計算發現突變體外表皮硅化細胞的長度極顯著小于野生型（圖2-B、圖2-F和圖2-J）。表明突變體籽粒變短是由于穎殼細胞縱向擴展水平降低，從而導致細胞變短。

由于掃描電鏡的拍攝平面和橫向細胞的不規則排列問題，通過石蠟切片分析了野生型和突變體開花期小穗穎殼的橫向細胞特征和數目。結果顯示，外稃和內稃的細胞組成和特征在突變體和野生型之間并無明顯差異，由外向內都是由4層細胞組成，包括1層硅化明顯的外表皮，3—6層細胞壁染色較深、尺寸較小的厚壁細胞，2—3層染色較淺、尺寸較大的薄壁細胞，以及1層的內表皮細胞（圖2-D和圖2-H）。分別統計外稃橫向的外表皮細胞、厚壁細胞和內表皮細胞的總數目，發現突變體橫向細胞總數量極顯著增多，其中，外表皮細胞、厚壁細胞增加幅度達到8.3%和9.3%（圖2-K、圖2-M和圖2-O）；進一步統計分析，發現外表皮細胞和內表皮細胞的橫向寬度也均極顯著高于野生型（圖2-L和圖2-N）；隨后，通過統計相同位置的細胞數目和面積，計算得出突變體橫向厚壁細胞大小為125 μm2，極顯著高于野生型35%（圖2-P）。以上結果表明，突變體籽粒變寬是由于穎殼細胞橫向細胞增殖與細胞擴展同時增加所導致。

綜上所述，一方面通過正向調控穎殼縱向細胞擴展影響籽粒長度，另一方面通過同時抑制穎殼的橫向細胞增殖和細胞擴展影響籽粒寬度。

2.3 swg1突變體的遺傳分析

突變體與不育系56S雜交后，F1植株表現正常，F2群體植株則表現出顯著的性狀分離，其中，正常植株308株，突變表型植株95株，分離比為3.242﹕1，經卡平方測驗其分離比符合3﹕1（2=0.438＜20.05=3.84），表明的性狀受隱性單基因控制（表2）。

A：野生型和突變體成熟期的株型對比；B：野生型和突變體成熟期的穗型對比；C：野生型和突變體的籽粒；D：野生型和突變體的米粒；E：穗長；F：一次枝梗數；G：每穗粒數；H：二次枝梗數；I：千粒籽粒重；J：千粒米重；K：籽粒長度；L：籽粒寬度；M：籽粒長寬比；N：米粒長度；O：米粒寬度；P：米粒長寬比。*：在p＜0.05水平差異顯著；**：在p＜0.01水平差異極顯著。下同

表2 swg1短寬粒性狀的遺傳分析

2.4 SWG1的定位

選用一套平均分布在水稻12條染色體的SSR引物，對56S、突變親本進行多態性分析；隨后在F2中分別隨機選取野生型植株和突變體植株各10株構建基因池，用親本間差異引物分析突變基因池和正常基因池，發現第7染色長臂端的分子標記RM21934和RM21979在2個基因池具有多態性；用這兩個標記分析50個F2突變株，重組子個數分別為5和4，且目標基因位于2個標記之間。為進一步縮小定位區間，在RM21934和RM21979之間進一步篩選多態性分子標記，發現RM21968與RM234在親本和基因池間具有多態性。繼續用這兩個標記分析56株F2突變株，重組子個數都為1，目的基因定位于RM21968與RM234分子標記之間（圖3-A）。

2.5 SWG1候選基因分析

通過查詢日本晴序列在定位區間分子標記RM21968（25.36 Mb）和RM234（25.47 Mb）（110 kb）之間的基因，共有18個注釋基因（圖3-B），包括、、編碼含有結構域的蛋白質；、、、均編碼轉座子蛋白；、、、編碼不同的酶類或組成酶的亞基；編碼核糖體蛋白S2；、、、均編碼蛋白質；編碼轉錄因子（表3）。

為確定候選基因，對野生型XD1B和突變體進行了基因組重測序，比對定位區間重測序結果，發現_的第一個外顯子第389個堿基發生了單堿基替換，由胞嘧啶（C）變成胸腺嘧啶（T），隨后通過PCR進行擴增比對，確定突變體中位點的確發生了C-T的替換，從而導致翻譯的蛋白質由原本的脯氨酸變成絲氨酸，因此，將暫定為的候選基因（圖3-C）。

A：掃描電鏡下野生型的穎殼外表面，標尺=4 mm；B：掃描電鏡下野生型的外稃外表皮局部，標尺=400 μm；C：野生型小穗橫切面的石蠟切片，標尺=2 mm；D：野生型小穗橫切面的石蠟切片局部及細胞類型標注；E：掃描電鏡下突變體的穎殼外表面，標尺=4 mm；F：掃描電鏡下突變體的外稃外表皮局部，標尺=400 μm；G：突變體小穗橫切面的石蠟切片，標尺=2 mm；H：突變體小穗橫切面的石蠟切片局部及細胞類型標注；I：外稃縱向上外表皮細胞數目的統計；J：外稃縱向上外表皮細胞長度的統計；K：外稃橫向上外表皮細胞數目的統計；L：外稃橫向上外表皮細胞寬度的統計；M：外稃橫向上內表皮細胞數目的統計；N：外稃橫向上內表皮細胞數目的統計；O：外稃橫向上厚壁細胞數目的統計；P：外稃橫向上厚壁細胞面積的統計。LE：外稃；OEP：外表皮細胞；SC：厚壁細胞；PA：內稃；IEP：內表皮細胞

A: The epidermis of wild-type glume under scanning electron microscope, Bar=4 mm; B: The epidermis of lemma of wild type under scanning electron microscope, Bar=400 μm; C: Paraffin section of cross section of wild-type spikelets, Bar=2 mm; D: Partly paraffin section and cell type labeling on the cross section of wild-type spikelets; E: The epidermis of mutant glume under scanning electron microscope, Bar=4 mm; F: The epidermis of lemma of mutant under scanning electron microscope, Bar=400 μm; G: Paraffin section of cross section of mutant spikelets, Bar=2 mm; H: Partly paraffin section and cell type labeling on the cross section of mutant spikelets; I: Statistics of the number of outer epidermal cells in lemma longitudinal direction; J: Statistics of the length of outer epidermal cells in lemma longitudinal direction; K: Statistics of the number of outer epidermal cells in lemma transverse direction; L: Statistics of the width of outer epidermal cells in lemma transverse direction; M: Statistics of the number of inner epidermal cells in lemma transverse direction; N: Statistics of the number of inner epidermal cells in lemma transverse direction; O: Statistics of the number of sclerenchyma cells in lemma transverse direction; P: Statistics of the area of sclerenchyma cells in lemma transverse direction. LE: lemma; OEP: Outer epidemics; SC: sclerenchyma cells; PA: parenchyma cells; IEP: inner epidermal cells

圖2 野生型和穎殼的組織細胞學分析

Fig. 2 Histocytology analysis of wild-type andmutant glumes

2.6 SWG1候選基因的遺傳互補驗證

包含10個外顯子，開放閱讀框全長7 850 bp，CDS全長4 098 bp，編碼包含1 365個氨基酸的蛋白質。為了佐證的突變是導致突變體表型的原因，設計特異引物擴增野生型中的（包括3 417 bp啟動子、基因組DNA 7 850 bp及60 bp下游序列），構建互補表達載體（圖4-A），隨后，將此表達載體運用農桿菌侵染法轉入中。

共獲得17株T0轉基因植株，使用外源轉基因檢測引物進行擴增（圖4-A中F1、R1），結果表明，有7株為陽性植株（圖4-B）；進一步用內源突變位點檢測引物（圖4-A中F2、R2）擴增片段進行測序分析，結果表明，7株陽性植株全部含有純合突變體位點（圖4-C）。觀察分析這些轉基因植株抽穗期和成熟期的表型，發現這些轉基因植株中穗型、粒型性狀全都與野生型類似，完全恢復正常（圖4-D—H）。上述結果證明，就是。在先前的研究中被鑒定為直立密穗基因，編碼一個植物特有的轉錄因子[32]。

A：SWG1的精細定位；B：定位區間內的18個開放閱讀框；C：SWG1的基因結構及突變位點。Ser：絲氨酸；Pro：脯氨酸；Arg：精氨酸

表3 定位區間內的注釋基因

A：pCAMBIA1300-SWG1載體示意圖；B：7株轉基因植株的陽性結果電泳圖；C：F2-R2片段的測序峰圖；D—F：野生型、突變體和互補植株的穗型，標尺=1 cm；G：野生型、突變體和互補植株籽粒的十粒長；H：野生型、突變體和互補植株籽粒的十粒寬

2.7 SWG1的表達模式分析

為明確的表達部位，運用qRT-PCR對的表達進行轉錄水平分析。結果表明，在植株中廣泛表達，在根、莖、葉、葉鞘、穗中均有表達，無明顯的組織特異性。特別地，在穗中，的表達隨著穗長度的增加而逐漸減少，在1和3 cm的幼穗中表達最為強烈，在7、9和11 cm的穗中也都有較高的表達（圖5）。穎殼由外稃和內稃組成，作為最早起始的花器官，1—3 cm是其細胞增殖最為劇烈的時期，而7—11 cm時期應該是處于細胞的擴展階段，因此，推測在穗發育各個階段的表達與其功能是相適應的。

圖5 SWG1在野生型中的qRT-PCR表達分析

2.8 粒型相關基因及細胞發育相關基因的表達

先前的研究認為編碼一個植物特有的轉錄因子[30]，為了了解的作用機制，通過qRT-PCR分析已知粒型調控基因在野生型和突變體之間的表達差異。由于水稻粒型的調控網絡復雜龐大，選取了部分通過影響穎殼細胞增殖和（或）細胞擴展調控粒長和粒寬的代表性基因，包括、、、、、、、和。結果發現，與野生型相比，促進穎殼橫向細胞分裂和擴展的、促進穎殼橫向細胞分裂的在中均呈極顯著上調表達；同時，（促進穎殼細胞分裂調控粒長）、/（調控細胞分裂與擴展，正向調控粒長、負向調控粒寬）、（促進細胞分裂和細胞膨大調控籽粒大小）、（負向調控籽粒大小）和（影響細胞增殖和細胞擴展、負向調控水稻粒寬）呈顯著下調表達（圖6-A）。總之，和的上調表達、/、及的下調表達與突變體籽粒由于穎殼細胞數目變多、細胞變大導致的籽粒變寬表型相吻合，而突變體由于細胞變小導致的粒長減少也與/、的下調表達相一致。

為進一步明確突變體穎殼細胞增殖和擴展的變化原因，檢測了部分細胞周期相關基因和細胞擴展相關基因的表達。結果顯示，與細胞分裂相關的大部分基因上調表達，其中，表達上調37%，表達上調29%（圖6-B），揭示的橫向細胞數目變多可能是由于細胞分裂增強所導致；同時，在6個檢測的細胞擴展相關基因中，4個上調表達，2個下調表達，其中，、和表達量上升40%左右，表達量上升近1倍（圖6-C），而和則呈明顯的下調表達。結果表明，突變體穎殼細胞大小的變化的確與細胞擴展有關。

總之，可能通過轉錄調控部分已知的粒型基因的表達，進而影響了部分與細胞周期和細胞擴展相關基因的表達，決定了穎殼細胞數目和大小的發育，最終參與了籽粒形態的發育。

3 討論

3.1 swg1突變體是dep2的新等位突變體，同時調控籽粒形態和穗部性狀發育

本研究從XD1B的EMS誘變群體中鑒定到一個短寬粒突變體，通過圖位克隆和遺傳互補試驗將候選基因定為，其編碼一個轉錄調控因子。先前報道了該基因的多個等位突變體，其中，、、均表現出植株矮化、直立密穗、葉片直立等表型；Zhu等[31]認為的莖稈更粗，且最上部節間的維管束組織多于野生型，增加了節間的機械強度，從而導致植株直立。Li等[32]研究發現的一次枝梗與二次枝梗數目與野生型相比無顯著變化，但細胞增殖異常導致了穗長減短，這可能是產生密穗表型的原因。Zhu等[33]研究表明OsRELA作為轉錄調節因子，通過調控的轉錄活性控制莖中細胞、近軸側薄壁細胞、遠軸側薄壁細胞的生長，從而對葉片角度和株高有正向調節作用。另外一個等位突變體表現出小圓粒的性狀，認為籽粒變短是由于細胞長度和細胞數量均下降，而籽粒變寬是由于細胞橫向寬度增加[34]。本研究鑒定的同時表現出直立密穗和短寬粒等性狀，這符合先前等位突變體的表型，說明是的新等位突變體。然而，雖然的短寬粒表型與先前等位突變體的小圓粒表型一致，都是長度減少和寬度增加；但這種宏觀表型變化背后的細胞學表型卻具有明顯差異，先前研究表明突變體穎殼外表皮細胞較野生型更短更寬，籽粒的變化是由于細胞擴展異常導致[31]；突變體籽粒變化可能是由于細胞增殖異常[32]，籽粒穎殼縱向細胞變大且細胞數目增多，橫向細胞變寬[34]。而在本研究中，穎殼在縱向上的細胞數目沒有顯著差異，其變短完全是由于細胞縱向擴展不足；另外在橫向上，除了與一樣細胞變寬變大以外，還表現出細胞數目增多，導致這種差異可能的原因是突變位點的不同，的突變發生在第6外顯子區域，、均在該基因的第7外顯子區域發生了突變，而本研究是的第一個外顯子區域發生了突變，不同位點的突變可能導致SWG1蛋白的結構發生變化，進而改變了蛋白功能，導致SWG1蛋白所處調控途徑的上下游基因出現差異，從而表現出最終表型（細胞學）上的不同。但SWG1蛋白不具有任何已知的結構域，若要明確SWG1蛋白與籽粒穎殼細胞發育的關系，需要對其蛋白結構進行深入研究。

A：野生型和突變體中粒型相關基因的轉錄水平；B：野生型和突變體中細胞分裂相關基因的轉錄水平；C：野生型和突變體中細胞擴展相關基因的轉錄水平

3.2 SWG1在籽粒長寬上進行相反的調控

目前，已報道大量與水稻籽粒形態發育相關的基因，它們大多是通過細胞增殖或（和）細胞擴展影響穎殼發育，但多數基因對籽粒形態發育的影響都比較單一，在籽粒長度和寬度上表現出一致的調控，或僅僅調控其中一方面。本研究進行了詳細的細胞學分析，發現穎殼縱向上細胞數目不變而長度減少，橫向上細胞數目和大小均增加，明確了一邊通過正向調控細胞擴展影響籽粒長度，一邊通過負向調控橫向細胞增殖和細胞擴展影響籽粒寬度，特別是在細胞擴展上呈現出縱橫2個方向上相反的調控方式。本研究進一步發現的突變影響了多個籽粒大小發育相關基因的表達。其中，、的上調表達、/、的下調表達與的表型高度一致。編碼一個絲氨酸羧肽酶，具有加強BR信號傳導的功能，最終促進水稻穎殼細胞分裂和擴展正向調控籽粒寬度[21]。/的上調表達能增加谷粒的縱向細胞分裂和伸長，并減少橫向細胞分裂和擴展，導致谷粒變得細長；而是一個包含SBP結構域的轉錄因子，能夠直接與啟動子結合并抑制它的表達[29-30]。所以，在中，/的下調表達可能是上調表達的結果，而不是突變的直接結果。TGW2編碼細胞數目調控因子OsCNR1，通過與調控細胞周期的KRP1蛋白互作影響細胞增殖和細胞生長，負向調控水稻粒寬[28]，所以，在中，的下調表達與穎殼細胞橫向分裂和擴展增加也是高度吻合。因此，推測編碼的轉錄因子可能直接或間接參與了、和的轉錄調控，從而決定籽粒的形態發育。

除了這些基因以外，籽粒大小調控基因和在突變中也表現出明顯的下調表達，但是與的表型并不是十分匹配；的作用機制與相似，和BR信號途徑相關，通過促進細胞分裂和細胞擴展正向調控籽粒大小[23-26]，所以，在中，的下調表達與縱向細胞伸長不足是相適應的，但是與橫向的細胞分裂與擴展加強是矛盾的，推測其對突變體橫向細胞的影響可能有其他基因作用作屏蔽。屬于G蛋白信號途徑，編碼一個非典型的Gγ亞基，通過與或競爭性結合Gβ亞基，從而負向調控籽粒長度[3-5]，但是其表達明顯下調似乎與籽粒變短表型是不匹配的；先前的研究表明不同的結構域變異會導致其功能相反，OSR結構功能的丟失會導致形成長的籽粒，而C端TNFR/NGFR和VWFC結構域功能域失活突變會產生非常短的籽粒[4]。因此，要明確的表達與表型的關系，需要進一步去分析突變體中蛋白是屬于哪種類型。

4 結論

從秈稻保持系XD1B的EMS誘變群體中鑒定到一個短寬粒突變體。相較于野生型，突變體粒長變短，粒寬增加，呈短寬粒的表型；突變體穎殼縱向細胞變短是導致粒長變短的主要原因，而粒寬增加是由于穎殼橫向細胞數目和細胞大小同時增加導致。該突變性狀受隱性單基因——控制，其編碼一個植物特異轉錄因子，無組織特異性表達，但在莖、葉、幼穗中表達量較高，正向調控穎殼橫向細胞數目和（或）細胞大小，可能通過轉錄調控部分已知的粒型基因，進而影響了部分細胞周期和細胞擴展相關基因的表達，決定了穎殼細胞數目和大小的發育，最終參與了籽粒的形態發育。

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Map-based Cloning of theGenein Rice (L.)

Zhu HongHui, Li YingZi, Gao YuanZhuo, Lin Hong, Wang ChengYang, Yan ZiYi, Peng HanPing, Li TianYe, Xiong Mao, Li YunFeng

Rice Research Institute, Southwest University/Academy of Agricultural Sciences, Southwest University/Chongqing Key Laboratory of Application and Safety Control of Genetically Modified Crops, Chongqing 400716

【】Rice yield is composed of effective panicle number per unit area, grains per panicle and grain weight, in which grain weight is mainly determined by grain morphology. Screening and identification of new grain type mutation materials and genes can lay a foundation for molecular design breeding of yield traits. 【】A short and wide grain mutant() was identified in the mutant population of indica rice maintainer line Xida1B(XD1B) induced by ethyl methane sulfonate (EMS). The grain morphology and other agronomic characters were analyzed, and the glume was observed and analyzed by histocytology. Gene mapping was carried out by BSA method, and candidate genes were identified by genetic complementarity experiment. qRT-PCR was used to analyze the expression pattern of the gene and the expression level of other genes related to grain shape and cell development.【】The analysis of agronomic characters showed that the grain length ofmutant was significantly lower and the grain width was significantly higher than that of wild type, showing the phenotype of short and wide grains, and further histological and cytological analysis showed that the shortening of longitudinal cells of glume was the main reason for the shortening of grain length, while the increase of grain width was due to the increase of the number and size of transverse cells of glume at the same time. The results of genetic analysis showed that the mutation was controlled by a recessive single gene, and the candidate gene forwas determined to beby map-based cloning and genetic complementary verification, which encoded a plant-specific transcription factor. qRT-PCR analysis showed that the expression of this gene had no obvious tissue specificity, and its expression is strong in stem, leaf and young panicle. According to the analysis of the expression of known genes related to grain shape, cell cycle and cell expansion, it was found thatand, which positively regulate the number and/or size of glume transverse cells to determine grain width, were significantly up-regulated in the mutants, while/genes, which positively regulated the number and size of longitudinal cells and negatively regulated the number and size of transverse cells, were significantly down-regulated in the mutants. Some genes related to cell cycle and cell expansion also showed significant differences between mutants and wild types. 【】encodes a plant-specific transcription factor, which affects glume cell proliferation and cell expansion by regulating grain shape genes,and G/, thus determining rice grain length and width.

rice (L.); grain; development of glumes; gene mapping

2022-12-08；

2023-01-16

國家自然科學基金（32172044，31971919）、重慶市杰出青年基金（cstc2020jcyj-jqX0020）、重慶市英才計劃（cstc2021ycjh-bgzxm0066）

朱洪慧，E-mail：1365358436@qq.com。李映姿，E-mail：1121962708@qq.com。朱洪慧與李映姿為同等貢獻作者。通信作者李云峰，Tel：023-68251264；E-mail：liyf1980@swu.edu.cn

（責任編輯 李莉）