補(bǔ)腎活血湯對(duì)膜性腎病大鼠足細(xì)胞的保護(hù)作用

[摘" "要]" "目的：利用被動(dòng)型Heymann腎炎（passive Heymann nephritis， PHN）模型探討補(bǔ)腎活血湯對(duì)血清IL-6、TNF-α的影響及對(duì)大鼠足細(xì)胞損傷的保護(hù)作用。方法：利用兔抗大鼠 Fx1A 抗血清建立PHN模型，30只SD大鼠隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組和中藥組。中藥組PHN大鼠予補(bǔ)腎活血湯，1次/d，共28 d。治療前后檢測(cè)24 h尿蛋白定量；ELISA檢測(cè)血清IL-6和TNF-α水平；光鏡碘酸六胺銀染色（periodic acid-silver metheramine， PASM）及電鏡觀察腎臟病理改變，實(shí)時(shí)定量PCR（real time quantitative PCR， RT-qPCR）及免疫熒光檢測(cè)腎組織Podocin的mRNA及蛋白表達(dá)。結(jié)果：模型組腎小球足細(xì)胞足突廣泛融合，基底膜增厚伴上皮側(cè)電子致密物沉積，中藥組上述病理?yè)p傷減輕。與對(duì)照組相比，模型組24 h尿蛋白上升，腎臟Podocin的mRNA及蛋白表達(dá)下降，血清IL-6、TNF-α水平升高（P＜0.01）。與模型組相比，中藥治療后24 h尿蛋白、IL-6、TNF-α水平下調(diào)，足細(xì)胞Podocin表達(dá)得到部分恢復(fù)（P＜0.05）。結(jié)論：補(bǔ)腎活血湯可降低PHN大鼠24 h尿蛋白，減輕腎臟病理?yè)p傷，恢復(fù)足細(xì)胞Podocin的表達(dá)，補(bǔ)腎活血湯的治療機(jī)制可能與下調(diào)血清IL-6和TNF-α的水平相關(guān)。

[關(guān)鍵詞]" "膜性腎病；足細(xì)胞；Heymann腎炎；補(bǔ)腎活血湯；大鼠

[中圖分類號(hào)]" "R692" " " " " " " "[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]" "A" " " " " " " "[文章編號(hào)]" "1674-7887（2023）01-0030-05

Effects of Bushen Huoxue Decoction on ameliorates podocyte injury

in membranous nephropathy rat*

TANG Xinbin ZHANG Rong ZHANG Yuan TAN Zhuojing SONG Jiaqi WANG Yao CHEN Minyue YUAN Jianlei YUAN Li（1Department of Nephrology， the Affiliated Hospital of Nantong University，Nantong 226001; 2Graduate School of Dalian Medical University）

[Abstract]" "Objective： To explore the therapeutic effect of Bushen Huoxue Decoction（BSHX） on podocyte injury and the influence on the levels of serum IL-6 and TNF-α in rat with passive Heymann nephritis（PHN）. Methods： The PHN model induced by rabbit anti-rat Fx1A serum， 30 rats were randomly divided into control， PHN model and traditional Chinese medicine（TCM） group. The rats with PHN in TCM group were treated with BSHX once daily for 28 days. The 24-hour urinary protein excretion was measured before and after treatment. The serum levels of IL-6 and TNF-α were tested by ELISA. The renal pathology with periodic acid-silver metheramine（PASM） stain as well as the electron microscopic for ultrastructure change was evaluated. The mRNA and protein of Podocin were detected by real-time quantitative PCR（RT-qPCR） and immunofluorescence in renal tissue. Results： Typical pathological features of PHN including extensive fusion of podocyte foot process， diffused thickened of glomerular basement membrane with subepithelial electron dense deposits were found in PHN model group while the injury was alleviated in TCM group. Compared with the control group， proteinuria excretion as well as the levels of serum IL-6 and TNF-α were increased（P＜0.01）， the expression of Podocin was decreased in rats with PHN significantly（P＜0.01）. Compared with the PHN model group， the levels of proteinuria， IL-6 and TNF-α were decreased significantly（P＜0.05）， while the expression of Podocin partially restored after treatment with BSHX. Conclusion： BSHX can decrease the 24-hour urinary protein， alleviate renal pathological injury， and restore the expression of Podocin in PHN rat. The therapeutic mechanism of BSHX may be related to reducing serum level of IL-6 and TNF-α.

[Key words]" "membranous nephropathy; podocyte; Heymann nephritis; Bushen Huoxue Decoction; rat

特發(fā)性膜性腎病（idiopathic membranous nephropathy， IMN）系成人腎病綜合征最常見(jiàn)的病理類型之一[1]。由于IMN特異性自身抗原的發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為IMN作為一種自身免疫性疾病，遺傳易感性和環(huán)境因素都是其發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵。從中醫(yī)的發(fā)病機(jī)制來(lái)說(shuō)IMN患者起病多因稟賦不足或感受外邪，外邪內(nèi)侵傷及臟腑，而出現(xiàn)臟腑功能失調(diào)，氣血津液運(yùn)行失常。

中醫(yī)藥治療除可以宏觀調(diào)節(jié)機(jī)體免疫外，對(duì)于局部損傷還具有靶向修復(fù)的作用，已證實(shí)在治療IMN中具有獨(dú)特的有效性及安全性[2]。南通大學(xué)附屬醫(yī)院腎內(nèi)科錢(qián)桐蓀主任使用中西醫(yī)結(jié)合治療慢性腎病有多年豐富的經(jīng)驗(yàn)，在此基礎(chǔ)上錢(qián)老總結(jié)出補(bǔ)腎活血經(jīng)驗(yàn)方，臨床使用于治療各種慢性腎炎效果良好。本研究建立兔抗大鼠Fx1A抗血清建立被動(dòng)型Heymann腎炎（passive Heymann nephritis， PHN）模型，觀察補(bǔ)腎活血方對(duì)PHN大鼠腎組織足細(xì)胞Podocin表達(dá)和分布的影響，以及血清中IL-6、TNF-α水平的變化，探討該方對(duì)膜性腎病大鼠足細(xì)胞的保護(hù)作用及相關(guān)機(jī)制。

1" "材料和方法

1.1" "實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑" "Sprague Dawley（SD）雄性大鼠30只，體質(zhì)量（200±20） g，普通級(jí)新西蘭兔，購(gòu)于南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心（動(dòng)物倫理編號(hào)：S20220214-001）。兔抗大鼠Podocin抗體（Sigma公司），IL-6、TNF-α ELISA試劑盒（上海聯(lián)碩生物科技有限公司）。補(bǔ)腎活血湯（組方：黃芪、黨參、川芎、肉蓯蓉、當(dāng)歸、凈萸肉、積雪草、萆薢和地龍，中藥飲片購(gòu)于南通大學(xué)附屬醫(yī)院）。

1.2" "PHN模型制備及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組" "從健康雄性SD大鼠中提取Fx1A抗原，免疫新西蘭兔獲取兔抗血清，使用前56 ℃滅活補(bǔ)體30 min[3]。SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周并檢測(cè)24 h尿蛋白定量＜10 mg后隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、模型組、中藥組，每組各10只。模型組和中藥組大鼠均予腹腔注射Fx1A抗血清0.8 mL/100 g體質(zhì)量，5 d后等量加強(qiáng)1次，代謝籠收集24 h尿，24 h尿蛋白定量＞10 mg為模型制備成功；對(duì)照組注射等容量生理鹽水[4]。

補(bǔ)腎活血湯中藥由南通大學(xué)附屬醫(yī)院制劑室提供，按比例稱取后水煎濃縮至每mL藥液含生藥量3 g。給藥劑量按藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物給藥方法（馬氏定理）[5]計(jì)算，均以成人劑量/（kg·d-1）的15倍灌胃。成模后，中藥組開(kāi)始灌胃，1次/d，其余2組予等量的生理鹽水，定期代謝籠收集24 h尿，給藥28 d后處死，采集標(biāo)本，進(jìn)行相應(yīng)各指標(biāo)的檢測(cè)。

1.3" "腎臟病理光鏡及超微結(jié)構(gòu)觀察" "收集尿液及采血后處死各組大鼠，腎臟標(biāo)本經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋切片，行碘酸六胺銀（periodic acid-silver metheramine， PASM）染色后，400倍光鏡下觀察組織變化。將腎組織標(biāo)本切成1 mm3的組織塊，2%鋨酸4 ℃固定，丙酮脫水、浸透，包埋后用超薄切片機(jī)切片，切片厚100 μm，5%醋酸鈾水溶液和枸櫞酸鉛雙染色后，觀察腎小球足細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)、電子致密物沉積及基底膜情況。

1.4" "實(shí)時(shí)定量PCR（real time quantitative PCR， RT- qPCR）" "TRIzol法抽提腎組織總RNA，取1 μg總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)賽默飛公司）合成各標(biāo)本第一鏈cDNA并進(jìn)行擴(kuò)增。Podocin上游引物：5′-CCTGTGAGTGGCTTCTTGTCCTC-3′，下游引物：5′-GGAGACGCTTCATAGTGGTTTGCA-3′。β-actin上游引物：5′-ATGCCATCCTGCGTCTGGACCTGGC-3′，下游引物：5′-AGCATTTGCGGTGCACGATGGAGGG-3′。應(yīng)用羅氏SYBR Green熒光染料，伯樂(lè)CFX96TM PCR儀進(jìn)行Real-time qPCR，反應(yīng)體系20 μL，擴(kuò)增條件：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃ 15 s，58 ℃ 30 s，60 ℃ 60 s，共40個(gè)循環(huán)；溶解曲線95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。通過(guò)2－ΔΔCT法分析各組間mRNA的表達(dá)差異。

1.5" "腎組織Podocin表達(dá)的檢測(cè)" "石蠟切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水，經(jīng)抗原修復(fù)、洗片、山羊血清37 ℃下封閉30 min，Podocin抗體（1∶400）于4 ℃孵育過(guò)夜，熒光二抗在室溫下避光2 h。光鏡下每張切片分別連續(xù)采集10個(gè)視野，對(duì)Podocin的分布情況進(jìn)行觀察，并使用Image-Pro Plus 6.0軟件對(duì)每個(gè)腎小球積累光密度值及熒光面積進(jìn)行測(cè)定，以兩者之比為平均光密度值。

1.6" "各組大鼠血清IL-6和TNF-α水平" "經(jīng)腹主動(dòng)脈負(fù)壓采血，3 000 r/min離心取血清，將樣品加入各反應(yīng)孔，37 ℃反應(yīng)45 min。用洗滌液洗4次，再加入生物素標(biāo)記的抗體，在37 ℃孵育30 min，洗滌后加鏈霉親和素-辣根過(guò)氧化物酶混合均勻，37 ℃反應(yīng)30 min。加入顯色劑避光顯色，最后加終止液終止反應(yīng)，檢測(cè)結(jié)果。

1.7" "統(tǒng)計(jì)學(xué)方法" "采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)后采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用秩和檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2" "結(jié)" " " 果

2.1" "各組大鼠24 h尿蛋白定量比較" "3組大鼠24 h尿蛋白在造模前差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Pgt;0.05）：造模完成后與對(duì)照組相比，模型組及中藥組24 h尿蛋白定量明顯升高（P＜0.01）；給藥14 d及28 d，中藥組24 h尿蛋白雖仍高于對(duì)照組（P＜0.01），但均較同期模型組下降（P＜0.05），見(jiàn)表1。

2.2" "各組大鼠腎臟的病理學(xué)改變" "腎組織切片PASM染色結(jié)果顯示，模型成功后可見(jiàn)腎小球毛細(xì)血管壁僵硬感、上皮側(cè)可見(jiàn)嗜復(fù)紅物沉積和釘突形成。與模型組相比，中藥組腎小球基底膜增厚程度減輕，釘突形成減少。透射電鏡觀察可見(jiàn)模型組腎小球廣泛的足突融合，局部呈板層狀，足突裂孔消失，上皮下電子致密物沉積。中藥組損傷較對(duì)照組明顯減輕，表現(xiàn)為足突融合減少，足突寬度變小（圖1）。

2.3" "各組大鼠腎臟中Podocin的表達(dá)" "與對(duì)照組相比，模型組及中藥組大鼠腎臟中Podocin mRNA的表達(dá)均明顯降低（均P＜0.05）。雖然，與模型組相比，中藥組大鼠腎臟中Podocin mRNA水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），但中藥治療有抑制Podocin mRNA降低的趨勢(shì)（圖2A）。免疫熒光顯示對(duì)照組大鼠腎組織中Podocin沿腎小球毛細(xì)血管袢呈均勻連續(xù)線狀分布，表達(dá)高于模型組及中藥組（均P＜0.05）；模型組大鼠腎組織Podocin明顯減少，僅在部分毛細(xì)血管袢出現(xiàn)微弱的表達(dá)，與模型組相比，中藥組Podocin表達(dá)有所恢復(fù)（P＜0.05）（圖2B～C）。

2.4" "各組大鼠血清IL-6、TNF-α的表達(dá)" "對(duì)照組大鼠血清IL-6和TNF-α水平均低于其余兩組（均P＜0.05）；與模型組相比，中藥治療可以降低PHN大鼠血清IL-6和TNF-α的水平（P＜0.05）（圖3）。

3" "討" " " 論

有研究[6]提示中藥可有效降低臨床表現(xiàn)為腎病綜合征的IMN患者尿蛋白排泄，提高其血漿白蛋白；與經(jīng)典的激素+環(huán)磷酰胺方案相比，中藥治療不僅在改善和保護(hù)IMN患者腎功能方面更具優(yōu)勢(shì)，而且不良事件發(fā)生率更低，具有更高的安全性。但是，目前有效的中藥研發(fā)不足、作用靶點(diǎn)與機(jī)制缺乏系統(tǒng)深入的研究，導(dǎo)致其作用遠(yuǎn)未得到充分發(fā)揮。

中國(guó)古代醫(yī)籍并無(wú)“特發(fā)性膜性腎病”病名，根據(jù)其臨床癥狀及特征，當(dāng)屬于中醫(yī)學(xué)中“虛勞”、“水腫”、“尿濁”、“腰痛”等范疇。該病病因病機(jī)復(fù)雜，中醫(yī)各家對(duì)其研究甚多，認(rèn)為本病多為內(nèi)外因素共同作用的結(jié)果，證屬本虛標(biāo)實(shí)。脾腎虧虛作為IMN的基本病機(jī)已被眾醫(yī)家所公認(rèn)，IMN中存在“虛”、“濕”、“瘀”、“熱”四大病機(jī)[7]，其中脾腎氣虛為本病發(fā)病的基本病機(jī)，而脾腎陽(yáng)虛是病變中后期病情久延、氣傷及陽(yáng)的病理轉(zhuǎn)變。補(bǔ)腎活血湯組成為黃芪、黨參、肉蓯蓉、萸肉、川芎、當(dāng)歸、積雪草、萆薢、地龍，此為本科室錢(qián)桐蓀教授臨床經(jīng)驗(yàn)方，其中黃芪、黨參、肉蓯蓉、萸肉健脾補(bǔ)氣益腎以補(bǔ)養(yǎng)先后天，即維護(hù)腎氣，扶正固本，配合使用當(dāng)歸補(bǔ)血通絡(luò)達(dá)到益氣補(bǔ)血，川芎活血化瘀，積雪草及萆薢清熱泄?jié)帷Ｔ摲焦沧嘟∑⒀a(bǔ)腎、益氣養(yǎng)陰、活血化瘀、清熱泄?jié)嶂πВ瑯?biāo)本兼治，與IMN臨床大多數(shù)病機(jī)契合。臨床上使用補(bǔ)腎活血湯治療IMN的患者，亦取得了降低蛋白尿，保護(hù)腎功能的良好效果。

Podocin是足細(xì)胞裂孔隔膜重要的細(xì)胞骨架蛋白之一，對(duì)維系腎小球?yàn)V過(guò)屏障的結(jié)構(gòu)和功能起關(guān)鍵作用，Podocin表達(dá)及分布異常是蛋白尿發(fā)生機(jī)制中的重要環(huán)節(jié)[8]。R.M.TIAN等[9]觀察參芪口服液對(duì)陽(yáng)離子化牛血清白蛋白誘導(dǎo)的大鼠膜性腎病的治療作用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)中藥治療可以降低病變大鼠腎臟足細(xì)胞Podocin的丟失，緩解病理改變。B.H.LIU等[10]在體外實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，TNF-α可以導(dǎo)致足細(xì)胞的凋亡以及Podocin的下降，而真武湯可以緩解上述的足細(xì)胞損傷。本研究結(jié)果與上述研究相似，補(bǔ)腎活血湯降低PHN大鼠尿蛋白，緩解腎臟基底膜的病變及免疫復(fù)合物沉積，并減輕腎臟足細(xì)胞Podocin的丟失。既往動(dòng)物實(shí)驗(yàn)[11]還發(fā)現(xiàn)，本方可以延緩阿霉素大鼠慢性腎病進(jìn)展，抑制另一種足細(xì)胞相關(guān)蛋白Nephrin的丟失。

研究[12]發(fā)現(xiàn)，IMN患者腎活檢組織中IL-6及TNF-α的表達(dá)升高，提示其在疾病的發(fā)生及發(fā)展中具有重要的地位。IL-6可促進(jìn)B細(xì)胞的活化、增殖和分化；TNF-α作為炎癥介質(zhì)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖、小管損傷，導(dǎo)致腎臟纖維化病變[13]。除了直接對(duì)足細(xì)胞的保護(hù)作用外，中藥治療IMN的機(jī)制之一是對(duì)機(jī)體整體的調(diào)節(jié)，包括改善炎癥環(huán)境[2]。黃芪是臨床上用于治療IMN的常用中藥，具有抗氧化和抑制炎癥的作用，在多個(gè)動(dòng)物腎病模型中均被證實(shí)有緩解蛋白尿及緩解腎臟損害的效果。有研究[14]認(rèn)為自由基失活，抑制一氧化氮產(chǎn)生及減少TNF-α產(chǎn)生與黃芪的腎保護(hù)作用相關(guān)。薛丕良等[15]研究發(fā)現(xiàn)參芪蛭龍湯對(duì)PHN大鼠的治療作用與調(diào)節(jié)血清中IL-2、TNF-α含量、降低胸腺及脾臟免疫器官重量及指數(shù)有關(guān)。本研究中模型組IL-6及TNF-α水平均較對(duì)照組顯著升高，經(jīng)以黃芪為君藥的補(bǔ)腎活血湯治療后，上述細(xì)胞因子水平均下降，提示該方劑能夠調(diào)節(jié)機(jī)體炎癥因子的異常表達(dá)。

綜上所述，補(bǔ)腎活血湯可以降低PHN大鼠24 h尿蛋白定量，減輕腎臟病理?yè)p傷，上調(diào)足細(xì)胞裂孔隔膜蛋白Podocin的表達(dá)，其機(jī)制可能與降低PHN大鼠血清IL-6和TNF-α的水平相關(guān)。本研究亦存在如下不足，首先實(shí)驗(yàn)所用PHN模型雖然是經(jīng)典的PHN動(dòng)物模型，但致病抗體的靶抗原megalin與人類IMN的抗原不同，不能完全模擬人類IMN的病變；其次，中藥方劑中成分復(fù)雜，尚需拆方分析對(duì)方劑的有效性進(jìn)一步驗(yàn)證。

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[收稿日期] 2022-03-07