基于Yes相關蛋白/同源異型盒轉錄因子通路探討淋巴管新生在高血壓心肌重構中的作用

劉晶晶 陳昌貴 孫茹雪 李立為

湖北省武漢市中西醫結合醫院（武漢市第一醫院）心血管內科重癥監護室（武漢430022）

心臟肥大的發展最初被認為是應對容量或壓力過載的一種適應性反應，但最終可能導致心力衰竭（heart failure，HF）［1］。盡管存在可以改善HF患者心臟功能障礙的治療方法，但病死率仍然很高，迫切需要發現預防HF 的新目標或替代治療策略。心臟有一個復雜的淋巴管網絡，對維持組織液平衡、免疫細胞販運和心臟功能至關重要。近年來，有研究注意到淋巴管功能損害參與壓力過載引起的心臟功能障礙，而刺激心臟淋巴管生成可改善心臟淋巴運輸和水腫，減少心臟炎癥和纖維化，并改善左心室功能，但其中機制仍有待進一步研究［2-3］。哺乳動物Hippo 信號通路是心血管系統中細胞命運、細胞分化、增殖、遷移和器官形態發生的重要調節者［4］。Hippo 通路的核心涉及大腫瘤抑制激酶1 和2、Yes相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）及其旁系同源物TAZ。最近發現，YAP 在血管生長和淋巴管生長的內皮細胞中高度富集，并在萌芽血管生成和血腦屏障成熟中發揮促進作用［5］。重要的是，研究發現YAP 通過調節同源異型盒轉錄因子（prospero-related homeobox domain 1，PROX1）表達參與淋巴內皮細胞可塑性［6］。然而，YAP/PROX1 通路是否調節壓力過載引起的心臟淋巴管功能損害修復仍不清楚。因此，本研究利用YAP 基因敲除小鼠檢查了YAP/PROX1 通路在橫主動脈收縮（transverse aortic constriction，TAC）誘發的心臟肥大和功能障礙中的潛在作用。同時，檢查了AngⅡ刺激的原發性小鼠淋巴管內皮細胞（lymphatic endothelial cells，LECs）的內皮細胞功能和淋巴管生成能力。

1 材料與方法

1.1 動物和分組處理20 只野生型（WT）小鼠和20 只YAP 基因敲除（YAP-KO）小鼠（8 周齡、雄性）均購自均購自杰克森艾特生物科技（北京）有限公司。實驗動物許可證號：SCXK（京）2019-0004。將YAP-KO 小鼠隨機分為兩組：假手術（Sham）+YAPKO 組（n= 10）和TAC+YAP-KO 組（n= 10），和將WT 小鼠隨機分為兩組：Sham+WT 組（n= 10）和TAC+WT 組（n= 10）。除Sham+YAP-KO 組和Sham+WT 組外，其他組建立6 周TAC 模型。

參照文獻方法，通過TAC 手術誘導小鼠心臟肥大和HF 模型的持續壓力過載［7］。小鼠用氯胺酮（0.2 g/kg）和賽拉嗪（0.01 g/kg）進行腹腔注射麻醉。在充分暴露橫主動脈后，將6-0 尼龍縫合線置于鎖骨和左頸動脈之間，將27 號鈍針置于橫主動脈處，并在及時拔出針頭后迅速打兩個結以產生65%～70%的收縮力。最后，用4-0 PROLENE 縫線縫合皮膚。對于Sham 小鼠，除結扎外，所有操作都以相同的程序進行。

1.2 超聲心動圖和血壓測量在TAC手術后的6周，使用30 MHz 探頭進行超聲心動圖檢查。測量左心室射血分數（LVEF）、分數縮短（FS）、舒張末期左心室前壁尺寸［LVAW（d）］、舒張末期左心室后壁尺寸［LVPW（d）］、舒張末期的左心室內部尺寸［LVID（d）］、收縮末期的左心室前壁尺寸［LVAW（s）］、收縮末期的左心室后壁尺寸［LVPW（s）］、收縮末期的左心室內部尺寸［LVID（s）］。通過創尾套系統（美國Softron 公司）測量小鼠的收縮壓（SBP）、平均血壓（MBP）、舒張壓（DBP）和心率（HR）。

1.3 心臟水含量測量取出小鼠心臟的心房和大血管以評估心室的濕重。心室在65 ℃下干燥5 d后，獲得心臟干重。心肌含水量按以下公式計算：心臟含水量=（心臟濕重-心臟干重）/心臟濕重×100%。

1.4 組織病理學和免疫染色心臟組織在室溫下用4%多聚甲醛在磷酸鹽緩沖鹽水中固定48 h并嵌入石蠟中。將心臟組織切成5 μm 的切片用于以下分析。切片用小麥胚芽凝集素（WGA）染色以測量心肌細胞的大小。用Image J 對心肌細胞面積進行了量化。將載玻片與特異性淋巴管內皮細胞透明質酸受體1（lymphatic vessel endothelial receptor-1，LYVE1）（稀釋度，1∶200）的一級抗體在4 ℃下孵育過夜，進行免疫組織化學。次日，與二抗在37 ℃下孵育30 min，檢測LYVE1 的表達。

1.5 細胞培養小鼠LECs 購自美國Procell 公司，在含有5% 胎牛血清和1% 青霉素-鏈霉素的DMEM 基礎培養基中生長，溫度為37 ℃。在培養基中使用適當劑量的AngⅡ（10-6mol/L）處理48 h，對LECs 的功能和基因表達情況進行檢測。為了抑制YAP 在體外的表達，用50 nmol/L 的YAP小干擾RNA（si-YAP）轉染LECs 48 h。si-YAP 的序列是5′-GGAUGUAGCUGAGCUGCUUTTAAGCAGCUCA-GCUACAUCCTT-3′。為了在體外過量表達YAP、PROX1，使用YAP、PROX1 質粒轉染細胞。在轉染48 h 后收獲轉染了質粒或siRNA 的細胞并進行功能分析。LECs 分為以下6 組進行：對照（Control）組、AngⅡ+NC 組、AngⅡ+si-YAP 組、AngⅡ+YAP 組、AngⅡ+si-YAP+Vector 組和AngⅡ+si-YAP+PROX1 組。其中，Control 組細胞加入空白溶劑進行處理，AngⅡ+NC 組細胞加入si-NC、Vector轉染，其他組加入對應的小干擾RNA 或質粒進行處理。si-NC、si-YAP，YAP、PROX1 質粒和相應載體（Vector）均購自美國Ambion 公司。

1.6 傷口愈合試驗將處理后的LECs 培養在6 孔板中并形成單層。用黃色吸頭在單層LECs 表面進行1 mm 寬的線性劃痕，然后用含或不含AngⅡ的無血清培養基替換培養基，持續24 h。在隨機選擇的5 個區域測量相對愈合距離，并使用Image J 進行分析。

1.7 EDU 染色LECs 以每孔103～104個細胞的密度被接種到96 孔板中。將細胞在含有EDU 的培養基中培養24 h，并用4%的聚甲醛固定。用Apollo 標記EDU 陽性細胞，用Hoechst33342 標記細胞核。在熒光顯微鏡（日本Olympus 公司）下觀察EDU 陽性細胞。

1.8 Proteome ProfilerTM 陣列應用小鼠血管生成陣列試劑盒（美國R&D Systems 公司）進行因子篩選。收集細胞培養上清液。將阻斷緩沖液加入到膜上，在搖板上搖晃1 h。將樣品與15 μL 重組的檢測抗體雞尾酒混合，然后在室溫下孵育1 h，將混合物轉移到膜上孵育過夜。用鏈霉蛋白-HRP緩沖液孵育細胞30 min。通過加入Chemi Reagent混合液進行最終檢測，然后進行掃描。

1.9 PCR 分析用RNAeasy Plus 微型試劑盒（美國QIAGEN 公司）分離細胞的總RNA。使用RNA轉cDNA 預混合液（Clontech Laboratories）將分離的RNA 轉錄成cDNA。使用SYBR Green 試劑（瑞士Roche Diagnostics 公司）在StepOnePlus 系統（美國Life Technologies 公司）上進行實時PCR 反應。在所有實驗中，GAPDH 被用作參考基因，以使基因表達正常化。引物序列如下：ANG，正向5′-TGCCACAACTCATCCGACA-3′，反向5′-TCTGTTGCGGGTTTGAGT-3′；VEGF，正向5′-CCTGCCATACGCCACATCAT-3′，反向5′-TGCATGAAGCCATCCTTC-3′；MMP-9，正向5′-ATGGTTCTGCTCCTGGTAA-3′，反向5′-AGGTCTGCCTGCATTTCT-3′；IGFBP-3，正向5′-GAATGGCAGTGTGGACCTCT-3′和反向5′-CAGCCTCAAACTCCACCATT-3′；PROX1，正向5′-AAAGCAAAGCTCATGTTTTTATACC-3′和反向5′-GTAAAACTCACGGAAATTGCTAAACC-3′；GAPDH，正向5′-AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′，反向5′-TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA-3′。

1.10 蛋白質印跡分析使用含有蛋白酶混合抑制劑和磷酸酶混合抑制劑的放射免疫沉淀試驗緩沖液（瑞士Roche Diagnostics公司）制備細胞裂解液。取20 μg 的總蛋白通過4%～12% Bis-Tris 凝膠（美國Life Technologies 公司）解析，并轉移到聚偏二氟乙烯膜（美國Thermo Fisher Scientific 公司）。在4 ℃下將膜與以下針對指定靶蛋白的一抗進行探測：抗VEGFR3 抗體（1∶1 000）、抗LYVE1 抗體（1∶1 000）和抗GAPDH 抗體（1∶5 000）。隨后，將膜與過氧化物酶偶聯的抗小鼠或抗兔IgG 抗體一起孵育90 min。使用Western ECL 底物（美國Bio-Rad Laboratories）進行免疫印跡，并通過Image J 測量條帶的強度。

1.11 統計學方法所有結果均以均數±標準差表示。使用SPSS 22.0 進行統計分析。所有實驗數據均呈正態分布，并使用單向方差分析多組間的差異，然后用Fisher 最小顯著性差異檢驗進行事后配對比較。P＜0.05 認為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 YAP 缺失加重了TAC 誘導的高血壓心臟功能障礙與Sham+WT 組相比，TAC+WT 組小鼠EF%、FS%、LVAW 厚度和LVPW 厚度顯著下降（P＜0.05），和SBP、DBP、MBP、LVID 厚度顯著增加（P＜0.05）。TAC+YAP-KO 組小鼠EF%、FS%、LVAW 厚度和LVPW 厚度顯著低于TAC+WT 組（P＜0.05），并且LVID 厚度顯著增加（P＜0.05，圖1、表1）。

表1 WT 和YAP-KO 小鼠在TAC 手術6 周后或假性對照后的血壓和超聲心動圖參數Tab.1 Blood pressure and echocardiographic parameters of wild-type WT and YAP-KO mice after TAC operation for 6 weeks or sham control ±s

表1 WT 和YAP-KO 小鼠在TAC 手術6 周后或假性對照后的血壓和超聲心動圖參數Tab.1 Blood pressure and echocardiographic parameters of wild-type WT and YAP-KO mice after TAC operation for 6 weeks or sham control ±s

注：與Sham+WT 組比較，***P ＜0.001；與TAC+WT 組比較，###P ＜0.001

參數HR（bpm）SBP（mmHg）DBP（mmHg）MBP（mmHg）EF（%）FS（%）LVAW（d）（mm）LVPW（d）（mm）LVID（d）（mm）LVAW（s）（mm）LVPW（s）（mm）LVID（s）（mm）Sham+WT 組535 ± 12.96 116.02 ± 4.82 76.02 ± 3.74 88.51 ± 3.05 66.99 ± 2.99 37.38 ± 1.67 0.87 ± 0.04 0.71 ± 0.03 3.58 ± 0.03 1.36 ± 0.02 1.04 ± 0.02 2.23 ± 0.10 Sham+YAP-KO 組528 ± 11.32 115.72 ± 4.77 76.53 ± 3.62 88.93 ± 2.90 66.77 ± 1.92 36.29 ± 1.42 0.87 ± 0.03 0.71 ± 0.02 3.54 ± 0.18 1.38 ± 0.03 1.06 ± 0.03 2.22 ± 0.19 TAC+WT 組536 ± 18.83 159.84 ± 5.23***118.42 ± 3.23***118.85 ± 1.94***31.42 ± 6.15***20.72 ± 2.61***0.75 ± 0.03***0.64 ± 0.03***4.08 ± 0.14***1.05 ± 0.03***0.74 ± 0.04***3.08 ± 0.06***TAC+YAP-KO 組524 ± 7.45 162.41 ± 5.30 125.47 ± 2.84 124.31 ± 3.16 24.44 ± 3.64###13.18 ± 2.05###0.66 ± 0.02###0.58 ± 0.02###4.71 ± 0.15###0.90 ± 0.05###0.63 ± 0.03###3.93 ± 0.14###

圖1 各組代表性的M 型組織多普勒超聲心動圖Fig.1 Representative M-mode tissue Doppler echocardiography of each group

2.2 YAP 缺失加重TAC 誘導的心臟肥大和纖維化與Sham+WT 組相比，TAC+WT 組小鼠心臟質量比、心肌細胞大小和間質纖維化面積均顯著增加（P＜0.05）。與TAC+WT 組相比，TAC+YAP-KO組小鼠心臟質量比、心肌細胞大小和間質纖維化面積均顯著增加（P＜0.05）。

圖2 YAP 缺失加重TAC 誘導的心臟肥大和纖維化Fig.2 YAP deletion aggravates cardiac hypertrophy and fibrosis induced by TAC

2.3 YAP 是維持心臟淋巴管生成的必要條件與Sham+WT 組相比，TAC+WT 組小鼠淋巴微血管密度顯著降低（P＜0.05），并且TAC+YAP-KO 組小鼠淋巴微血管密度較TAC+WT 組進一步降低（P＜0.05）（圖3A）。此外，與Sham+WT 組相比，TAC+WT 組小鼠心臟水腫及心臟組織中YAP 蛋白表達顯著增加（P＜0.05），和血清VEGFC 水平以及心臟組織中VEGFR3、LYVE1 蛋白表達顯著降低（P＜0.05），并且TAC+YAP-KO 組小鼠上述指標的變化程度較TAC+WT 組更大（P＜0.05）（圖3B-F）。

圖3 YAP 的缺乏降低了TAC 誘導后的心臟淋巴管生成Fig.3 Lack of YAP reduces cardiac lymphangiogenesis induced by TAC

2.4 YAP 調節LECs 的功能如圖4A 所示，與對照組相比，AngⅡ+NC 組愈合面積顯著下降（P＜0.05），并且AngⅡ+si-YAP 組下降程度較AngⅡ+NC 組更大（P＜0.05），而AngⅡ+YAP 組的愈合面積較AngⅡ+NC 組顯著增加（P＜0.05）（圖4A-B）。進行EDU 染色試驗來檢查增殖。如圖4C、D 所示，與對照組相比，AngⅡ+NC 組LECs 的增殖顯著下降（P＜0.05），并且AngⅡ+si-YAP 組下降程度較AngⅡ+NC組更大（P＜0.05），而AngⅡ+YAP組LECs的增殖較AngⅡ+NC 組顯著增加（P＜0.05）。LECs的管形成檢查顯示，與對照組相比，AngⅡ+NC 組LECs 的管形成數量顯著下降（P＜0.05），并且AngⅡ+si-YAP 組下降程度較AngⅡ+NC 組更大（P＜0.05），而AngⅡ+YAP 組LECs 的管形成數量較AngⅡ+NC 組顯著增加（P＜0.05，圖4E-F）。

圖4 YAP 調節LECs 的遷移、增殖和管形成Fig.4 YAP regulates the migration，proliferation and tube formation of LECs

2.5 YAP 上調LECs 中PROX1 表達以加速淋巴管生成為了證實YAP 對LECs 影響的分子機制，研究應用小鼠血管生成陣列試劑盒對潛在的生長因子進行了篩選。發現了5 個頂級的分化因子：ANG、VEGF、MMP-9、PROX1 和IGFBP-3（圖5A）。然后利用PCR 進行驗證，結果顯示只有PROX1 水平在YAP 敲低后顯著下調（圖5B）。此外，與AngⅡ+si-YAP+Vector 組相比，AngⅡ+si-YAP+PROX1組LECs 的愈合面積、增殖細胞和管形成數量顯著增加（P＜0.05，圖5C-H）。

圖5 YAP 上調LECs 中PROX1 表達以加速淋巴管生成Fig.5 YAP upregulates PROX1 expression in LECs to accelerate lymphangiogenesis

3 討論

慢性壓力過載引起了與心臟纖維化和功能障礙有關的病理性肥大［8］。已發現多種分子事件和信號通路參與了這一過程，但確切的機制還需要探索。微循環，尤其是淋巴微血管循環，在保護心臟不受傷害方面起著重要作用［8］。心臟淋巴功能障礙發生在各種心血管疾病中，影響心肌液體平衡和炎癥，可能誘發血管功能障礙、心臟重塑和缺血應激后心臟功能障礙［9］。這項研究證明了YAP/PROX1 信號通路在心肌淋巴管生成中的重要性，這是從壓力過載誘導的肥厚過渡到HF 的一個新的調節途徑。YAP 敲除加重了壓力過載誘導的心臟淋巴管生成的減少，導致心臟水腫、肥大重塑和功能障礙。因此，本研究數據支持YAP 在持續壓力過載后心臟重塑和功能障礙的發病機制中發揮作用。

YAP 是Hippo 信號傳導途徑的主要下游效應器［10-11］。研究報道，YAP 信號通路參與了胚胎發育、組織再生和體細胞干細胞的平衡［12］。最近，YAP 因其在病理性淋巴管發展中的作用而引起越來越多的關注。在各種癌癥中，包括胃癌和非小細胞肺癌，YAP 異常激活與TNM 分期和淋巴轉移明顯相關［13］。關于淋巴管生成，YAP 通過調控PROX1 的表達，在重塑淋巴叢模式和產后淋巴瓣的維持中發揮促進作用［14］。此外，YAP 抑制劑verteporfin 不僅能減少淋巴管介導的腫瘤轉移，還通過促進淋巴消退應用于角膜移植后的免疫排斥［15-16］。本研究中，TAC 應激后YAP-KO 小鼠比WT 小鼠表現出更顯著的HF 特征。此外，使用LYVE1 作為LECs 的標記，本研究數據進一步表明，YAP-KO 引起的異常可能是由于淋巴微血管的密度下降造成。YAP 通過調節氧化應激和代謝重編程保護心臟免受內皮功能障礙的影響［17-18］。在本研究中，AngⅡ降低了LECs 的遷移、增殖和管形成，抑制YAP 可加劇降低程度，但YAP 過表達后則逆轉這些變化。本研究結果與ZHONG 等［19］報道的結果一致，在他們的研究中YAP 的激活促進了LECs 在感染后的增殖、侵襲和管形成。這些結果表明YAP 通過介導淋巴管的生成參與了TAC 誘導的心臟損傷的發展。

淋巴轉移的一個重要過程是局部淋巴管生成。研究人員發現，心肌細胞和淋巴內皮細胞之間的串聯是淋巴管生成的一個重要部分，生長因子可能是它們之間的信使［9，20］。本研究應用小鼠血管生成陣列試劑盒對潛在的生長因子進行了篩選。我們選擇血管生成陣列試劑盒出于以下原因：（1）一些細胞表面受體家族，如整合素α4β1 和α2β1［21-22］，已被報道為血管生成和淋巴管生成的調節因子，表明血管生成相關蛋白也可能對淋巴管生成有類似的影響。（2）本陣列試劑盒中包括的一些血管生成相關的生長因子，如ANG1、ANG2、PROX1、VEGF-C 和VEGF-A，被證明在淋巴管生成中起作用［23-24］。根據血管生成相關因子的表達，我們發現PROX1 與YAP 調節的淋巴管生成有關。PROX1 是主轉錄因子，控制著LECs 的分化和維持淋巴的完整性。與先前研究一致［6，25］，本研究證實了YAP/PROX1 信號通路在淋巴管生成中的調節作用，并且PROX1 上調有效逆轉了YAP 敲低對LECs 愈合、增殖和管形成的負面影響。因此，YAP/PROX1 信號通路可能是治療壓力過載引起的心臟功能障礙的潛在靶點。

總之，本研究確定了YAP/PROX1 信號通路是壓力過載誘導的心臟淋巴管生成、適應性肥大和HF 的關鍵調節因素。需要進一步的調查來闡明YAP 參與調節LECs 中PROX1 表達的分子機制，并測試YAP/PROX1 信號傳導在其他動物模型中預防心臟肥大和HF 的效果。

【Author contributions】Liu Jingjing performed the experiments and wrote the article.Chen Changgui and Sun Ruxue performed the experiments.Li Liwei designed the study and reviewed the article.All authors read and aplproved the final manuscript as submitted.