外周血miR-92a和miR-342在急性肺損傷的診斷及預后中的臨床價值

畢婧 黃波

安康市中心醫院呼吸與危重癥醫學科一病區（陜西安康725000）

急性肺損傷（acute lung injury，ALI）是由直接或間接損傷因素引起，如敗血癥、肺炎、吸入胃內容物、流行性病毒入侵、創傷、爆炸、煙霧吸入和窒息性吸入等，可能危及生命健康的疾病［1］。這些損傷因子誘導激活免疫細胞，隨后啟動異常免疫反應。由損傷因子激活的免疫細胞釋放過量促炎因子、趨化因子和蛋白酶，最終損傷肺實質細胞，如血管內皮細胞和肺泡上皮細胞［2］。當肺實質細胞大量受損，導致通氣功能障礙，呼吸功能迅速減弱。ALI 的特征包括肺泡上皮細胞和毛細血管內皮細胞通透性增加、彌散性肺間質和肺泡水腫、氣體交換障礙和低氧血癥，最終導致呼吸衰竭［3］。目前，沒有有效的藥物治療可提高ALI 患者生存率。微小RNA（microRNA，miRNA）是一種高度保守的單鏈RNA，長度約為22 個核苷酸，參與多種疾病的生理和病理功能，包括結核病［4］、ALI［5］、肺纖維化和腫瘤等［6］。miRNA 主要結合mRNA 的3′-非翻譯區（3′-UTR），以控制多種途徑和各種細胞過程，如炎癥免疫反應等［7］。LIU 等［8］研究提出，miR-92a 在膿毒癥引起的ALI 中介導肺部炎癥，可能是ALI 的一種新的診斷生物標志物。miR-342在脂多糖誘導的小鼠ALI 中表達顯著下調，而且發現miR-342 對A549 細胞炎癥損傷具有保護作用［9］。本研究旨在評價ALI 患者外周血miR-92a和miR-342 表達水平，確定miR-92a和miR-342 對ALI診斷臨床價值，并探討miR-92a和miR-342 與ALI風險相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料篩選2019年1月到2021年12月期間在我院就診的60 例ALI 患者，另選取同期在我院接受健康體檢的同齡者52 例作為對照組，其中男32 例，女20 例，年齡（58.22±9.28）歲。60 例ALI 患者進行隨訪，并根據生存狀態分為ALI 死亡組和ALI存活組，其中ALI死亡組20例，男12例，女8 例，患者年齡（57.23 ± 8.92）歲，ALI 存活組患者40 例，其中男25 例，女15 例，年齡（55.82 ±10.19）歲。

ALI 納入標準：（1）符合ALI 診斷標準［10］；（2）臨床資料完整，且配合完成本研究所需所有檢測；（3）患者及其家屬了解研究內容并簽署家屬知情同意書。排除標準：（1）合并其他惡性腫瘤者，包括肺癌、腎癌等；（2）合并免疫性疾病者，包括類風濕性關節炎、系統性紅斑狼瘡等；（3）長期服用藥物者；（4）與患者及其家屬溝通不暢者。本研究內容符合赫爾辛基宣言，并獲得本院倫理委員會批準。

1.2 臨床指標觀察和外周血采集

1.2.1 臨床評分所有患者入院24 h 內進行急性生理和慢性健康評分（acute physiology and chronic health evaluation，APACHE Ⅱ）和肺損傷預測評分（lung injury prediction score，LIPS）。

1.2.2 外周血采集所有研究對象清晨空腹靜脈抽血5 mL，利用生化檢測儀分析超敏C反應蛋白（high-sensitive C-reactive protein，hs-CRP）。

1.2.3 實時定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）分析外周血miR-92a和miR-342 表達水平Trizol 提取各受試者外周血總RNA，利用反轉錄試劑盒（ThermoFisher，美國）將RNA 反轉錄為cDNA，在PCR 儀（UNOII，德國）上進行擴增，反應條件為：94 ℃，2 min，94 ℃持續30 s，循環35 次，退火溫度為72 ℃，30 s，最后72 ℃持續7 min，以U6為內參，持續25 個循環。擴增產物在2%瓊脂糖凝膠電泳中分離，用溴化乙錠染色，并用GelDoc 系統（Bio-Rad，美國）進行分析。引物信息為，miR-92a， 正 向 5′ - ACACTCCAGCTGGGAGGTTGGGATTTGTCGC 反向，5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAA-TTCAGTTGAGA-3′；miR-342，正向5′-TCCTCGCT-CTCACACAGAAATC-3′，反向5′-TATGGTTGTTCA-CGACTCCTTCAC-3′；U6，正向5′-AACGAGACGACGACAGAC - 3′ ，反 向 5′ -GCAAATTCGTGAAGCGTTCCATA-3′。

1.3 統計學方法利用SPSS 20.0 進行統計學分析，計量資料采用（）表示，三組間比較采用單因素方差分析；計數資料采用百分比表示，組間采用χ2檢驗；利用受試者工作曲線（receiver operating characteristic，ROC）評價外周血miR-92a和miR-342 表達水平對ALI 診斷臨床價值，單因素和多因素回Cox 歸分析影響ALI 危險因素，以P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般資料比較本研究中對照組、ALI 存活組和ALI 死亡組患者年齡、性別、吸煙率以及原發疾病比較差異無統計學意義（P＞0.05），三組比較APACHEⅡ評分、LIPS 評分、CRP 差異有統計學意義（P＜0.05），與對照組相比，ALI 存活組和ALI 死亡組APACHEⅡ評分、LIPS 評分更高，外周血中hs-CRP 更高于對照組。見表1。

表1 一般臨床資料比較Tab.1 Comparison of general clinical data 例（%）

2.2 外周血miR-92a和miR-342 表達水平比較對照組外周血中miR-92a 相對表達水平為（1.07 ±0.05），miR-342 相對表達水平為（1.12 ± 0.11）；ALI存活組miR-92a 相對表達水平為（2.13 ± 0.12），miR-342 相對表達水平為（0.55 ± 0.04）；ALI 死亡組miR-92a 相對表達水平為（3.11 ± 0.11），miR-342 相對表達水平為（0.31 ± 0.02）。ALI 存活組miR-92a相對表達水平高于對照組（P＜0.05），ALI 死亡組miR-92a 相對表達水平高于ALI 存活組（P＜0.05）；ALI 存活組miR-342 相對表達水平低于對照組（P＜0.05），ALI 死亡組miR-342 相對表達水平低于ALI 存活組（P＜0.05）。

2.3 Cox 回歸單因素分析ALI 患者外周血miR-92a、miR-342 相對表達水平、APACHEⅡ評分、LIPS評分、CRP 等因素納入ALI 發生風險Cox 比例風險模型進行分析，單因素分析結果顯示APACHE Ⅱ評分、LIPS 評分、外周血中CRP 濃度、miR-92a 相對表達水平過高，miR-342 相對表達水平過低是ALI 患者發生死亡風險的危險因素（P＜0.05），見表2。

表2 Cox 回歸單因素分析Tab.2 Cox regression univariate analysis

2.4 Cox 回歸多因素分析Cox 回歸多因素分析結果表明，外周血CRP、miR-92a和miR-342 水平是影響ALI發生風險的獨立危險因素（P＜0.05），見表3。

表3 Cox 回歸多因素分析Tab.3 Cox regression multivariate analysis

2.5 外周血miR-92a和miR-342 水平診斷ALI 的ROC 分析根據ALI 診斷標準［11］，評價外周血中miR-92a和miR-342 相對表達水平對ALI 患者診斷臨床價值，結果顯示，miR-92a 曲線下面積為0.865（95%CI：0.722～0.902），靈敏度為84.39%，特異度為73.29%，截斷值為2.16；miR-342 曲線下面積為0.839（95%CI：0.728～0.950），靈敏度為82.19%，特異度為71.77%，截斷值為0.56。miR-92a和miR-342 聯合診斷曲線下面積為0.895（95%CI：0.855～0.963），靈敏度為86.87%，特異度為76.57%。見圖1。

圖1 miR-92a和miR-342 診斷ALI 的ROC 曲線Fig.1 ROC curve of miR-92a and miR-342 in the diagnosis of acute lung injury

3 討論

本研究中發現miR-92a 在ALI 外周血中表達上調，miR-342 外周血中表達下調，進一步Cox 回歸分析表明外周血CRP、miR-92a和miR-342 水平是影響ALI 發生風險的獨立危險因素（P＜0.05），ROC 曲線分析結果表明，外周血miR-92a和miR-342 相對表達水平對ALI 診斷有臨床價值。

ALI 是較為嚴重的健康問題，占肺損傷死亡例數的30%。從機制上講，ALI 是一種臨床呼吸系統疾病，可能發展為更為復雜的綜合征，即急性呼吸窘迫綜合征［12］。炎癥反應在ALI 的發生和維持中起著重要作用，促炎細胞因子TNF-α 和IL-1β，增加肺上皮通透性，進而誘導肺組織損傷和中性粒細胞聚集導致肺水腫［13］。最近研究表明，miRNA 在ALI 進展過程中起著關鍵調控作用。一些研究報道了miRNA 作為ALI 生物標志的作用以及它們作為該疾病治療靶點的潛在用途［14］。微陣列數據表明，ALI 誘導miRNA 異常表達，這些miRNA 的潛在靶點與許多生理病理過程相關，如炎癥和凋亡［15］。CHEN 等［16］研究提出，MiR-92a 在非小細胞肺癌組織和細胞中表達上調，miR-92a 過度表達促進非小細胞肺癌增殖、侵襲和遷移，并抑制細胞凋亡。LIU 等［17］研究發現miR-92a 可激活肺泡巨噬細胞和肺部炎癥，肺泡上皮細胞外泌體中的miR-92a 可能代表了ALI 的一種新的診斷生物標志物［8］。ALI中miR-92a 在ALI 中高表達，抑制miR-92a 可改善肺泡上皮細胞的氧化應激和炎癥反應，減少凋亡。本研究與上述報道一致，miR-92a 在ALI 進展中可能發揮重要調控作用，這種調控作用可能與ALI炎癥反應有關。

除此之外，研究表明miR-342 也是ALI 炎癥反應的關鍵調節因子，ZHU 等［9］提出miR-342 在LPS誘導的A549 細胞中表達顯著下調，且伴有炎性因子升高和細胞凋亡，而過表達miR-342 可降低LPS誘導的炎癥水平。WEN 等［18］報道miR-342 與Ⅱ型肺泡上皮細胞增殖和凋亡有關，在支氣管肺發育不良疾病治療中有一定前景。MiR-342 過度表達抑制NF-κB/p65 信號通路，促進百草枯誘導的細胞凋亡和氧化應激，并加重百草枯誘導的肺損傷［19］。本研究結果與上述報道一致，miR-342 在ALI 患者外周血中表達下調，而且在ALI 死亡組患者表達低于ALI 存活組。上述研究說明miR-342在ALI 進展中可能發揮炎癥有關的調控作用。

本研究尚存在不足之處，ALI 臨床樣本收集存在一定難度，后期研究過程中繼續增加樣本量，提高嚴謹性。另外，對于miR-92a和miR-342 在ALI中的具體分子機制仍需深入探究，進一步充實研究內容。綜上所述，外周血miR-92a和miR-342 水平與ALI 有關，二者聯合檢測可為ALI 早期預測提供臨床依據。

【Author contributions】BI Jing performed the experiments，designed the study and wrote the article.HUANG Bo revised and reviewed the article.All authors read and approved the final manuscript as sub-mitted.