基于近紅外光譜技術的草莓可溶性固形物與糖度的檢測分析＊

宋白玉，張瑞鑫，莊程翔，劉 哲，陳少華

（江蘇農林職業技術學院，江蘇 鎮江 212400）

近紅外光譜技術（Near Infrared，NIR）的信息量豐富，可以直接透過樣品的內部，波長范圍為800～2 500 nm。近紅外檢測技術具有多種成分同時分析、測量速度快、測試成本低、樣品無需預處理且不會遭到破壞、無需化學試劑等突出特點，堪稱“綠色檢測技術”[1]，在水果品質檢測中得到了廣泛的應用。

近紅外光是介于可見光和中紅外光之間的電磁波，光譜波長區域為780～2 526 nm，波數為12 820～3 959 cm-1。近紅外光譜主要是有機分子的倍頻與合頻吸收光譜[1]，它是由于分子振動的非諧振性使分子振動從基態向高能級躍遷時產生的。它記錄了含氫基團（C-H，O-H，N-H，S-H）分子化學鍵基頻振動的倍頻和合頻信息[2]，包含了絕大多數類型化合物及其混合物的質量濃度，或品質參數的豐富信息。可溶性固形物主要的組成基團是C-H 和O-H，因此適合用NIR 技術來分析。根據“朗伯-比爾”吸收定律[3]，不同的基團和同一基團在不同化學環境中的吸收波長有明顯差別，可以作為獲取有機物組成或性質信息的有效載體[4]。因此，NIR 光譜不僅能夠反映絕大多數有機化合物的組成和結構性能信息[5]，而且對某些無機離子化合物，也能夠通過它對共存的本體物質影響引起的光譜變化[6]，間接地反映它存在的信息，而且從近紅外反射光譜還能得到樣品的密度、粒度、高分子物的聚合度及纖維直徑等物理狀態信息[7]。

由于有機組分的各官能團在近紅外區具有多級吸收，且不同官能團之間的譜峰相互疊加[8]和固體樣品的散射等因素的影響。因此，近紅外光譜在某個波長點的漫反射吸光度[9]與有機組分的質量濃度或性質之間并不是簡單的線性關系[3]，必須采用化學計量學方法[4]解析復雜的近紅外光譜，建立光譜信息與有機組分之間的關系。

1 近紅外光譜定量分析中的化學計量算法

目前，光譜分析中定量分析中采用的化學計量學方法[5]主要有多元線性回歸、逐步多元線性回歸、主成分回歸、偏最小二乘法和人工神經網絡等[10]。本文采用了主成分回歸和偏最小二乘法進行分析，故在此只簡單介紹這2 種化學計量算法。

主成分回歸法（Principal Component Regression，PCR）[6]包括2 個步驟，首先是把原始數據進行主成分分析（Principal Component Analysis，PCA），它是以因子分析為基礎，將光譜數據向協方差最大方向投影，使數目較少的主成分成為原變量的線性組合，主成分最大限度地反映了被測樣品的組成和結構信息，而最小限度地包含噪聲，通過對主成分個數的合理選取，去掉代表干擾組分和干擾因素的主成分；然后再用其中的幾個主成分與物質的化學成分進行多元線性回歸，這就是主成分回歸分析的主要思想。其優點主要是可充分利用光譜數據的信息，增加了模型抗干擾能力[8]。但在分解光譜矩陣時，未考慮光譜矩陣與樣品成分矩陣之間的內在聯系，不能保證參與回歸的主成分一定與被測組分或性質相關。

偏最小二乘法（Partial Least-Square Method，PLS）[7]從20 世紀80 年代被開始應用于化學研究，現已成為化學計量學中最常用的多元校正方法，也是近紅外光譜分析上應用最多的回歸方法。PLS 也是一種基于因子分析的多元校正方法，與主成分回歸法的區別是：它不僅將響應矩陣進行分解，提取主因子，還將質量濃度矩陣進行分解提取主因子，具有更強的提供信息的能力，所建立的校正模型[5]更穩定，抗干擾能力更強。如同主成分回歸分析，在應用PLS 時，確定參與回歸的維數十分重要。

2 材料與方法

2.1 近紅外漫反射光譜掃描

本次試驗使用的是美國ASD 公司生產的Quality Spec?Pro 光譜儀，各參數設置如下：波長范圍為350～1 800 nm，光譜采樣間隔為1 nm，掃描次數為10 次，分辨率為3 nm（700 nm）、10 nm（1 400 nm）。近紅外波段（350～1 000 nm）選擇512 相元陣列硅（Si）檢測器，檢測距離為3 cm；短紅外波段（1 000～1 800 nm）選擇銦鎵砷（InGaAs）檢測器。探頭視場角為45°，光源是與光譜儀配套的12 V/30 W 鎢鹵燈。該NIR 裝置示意圖如圖1 所示。

圖1 NIR 測量裝置示意圖

在光譜采集前，對ASD 光譜儀預熱2 h，并穩定光源15 min，以白板作為參比標準，在溫度20 ℃及相對濕度55%的條件下，將草莓置于NIR 光譜采集系統上，對每個草莓樣品進行1 次光譜測量，掃描點選擇表面圓滑部位，然后，換角度再進行1 次光譜掃描。計算機自動計算得到樣品漫反射光譜，并取2 次測量的平均光譜。掃描后的譜圖如圖2 所示。

圖2 單個草莓樣品的近紅外漫反射譜圖

從圖中可以看出，譜線在670 nm、950 nm、1 175 nm 及1 425 nm 附近有明顯的特征峰值。

2.2 草莓樣品可溶性固形物含量的化學測定

試驗樣品均采于本課題組位于金華赤松鎮的草莓試驗基地，采后即用冰盒帶回實驗室，放置平板上待果實恢復室溫后即進行樣品的光譜檢測和SSC（Soluble Solids Content）測定，試驗在當天完成。在對樣品進行測量前，首先用半干的毛巾擦干凈水果表面，再對樣本進行預處理后進行排序標記并確定光譜采樣范圍。試驗樣品共150 個，在建模過程中，由軟件隨機分為2 組，即校正組和驗證組，樣品分別為112和38 個，樣品溫度與室溫平衡后即進行點對點的光譜采集與SSC 的測定。

本試驗采用折射式數字糖度計[2]進行測量。采集完光譜后，擠出草莓果汁，滴到糖度計的小槽中，滴滿為止，然后進行可溶性固形物的測量。

2.3 模型的建立與數據處理

應用定量分析軟件The uascrambler 9.6 建立草莓可溶性固形物含量校正模型。建模采用2 種多元校正方法，即主成分分析和偏最小二乘法。將可溶性固形物含量的實測值導入該軟件，在建模過程中隨機選擇112 個作為建模樣品，38 個作為預測樣品。用未參與建模的樣品對模型進行驗證，評價模型的可行性，比較PCR 和PLS 的預測性能。

2.4 最適譜區的選擇

在近紅外光譜分析過程中，一般在通用的光譜儀上掃描一個樣品會得到上千個數據點。光譜圖譜帶重疊嚴重、背景復雜，其信息量非常豐富，這給定性和定量分析帶來了巨大困難。傳統觀點認為主成分分析、偏最小二乘法具有較強的抗干擾能力，可全波長參與多元校正模型的建立。

隨著多組分混合物光譜定量分析研究的日趨活躍和深入，發現選取一定范圍的光譜甚至是幾個特定的波長點處的吸收值進行定標不但可以簡化計算，還可以提高模型的穩定性和預測能力。當采用全譜區進行計算建模時，不僅計算量大，而且在某些光譜區域樣品的光譜信息很弱或與樣品的組成或性質缺乏相關關系，引入這樣的變量會造成多元校正模型的精度降低甚至錯誤。如果對建模的光譜譜區進行選擇，將有利于簡化模型、減少噪聲影響，提高運算效率和模型的穩定性。

本研究選擇不同的譜區采用PLS 和PCR 這2 種方法分別建立不同譜區的校正模型，根據它們的預測效果，得到建立校正模型的最適譜區。

2.5 光譜預處理

由于儀器、樣品背景或其他因素影響，近紅外光譜分析中經常出現譜圖漂移或偏移現象，如不加處理，同樣會影響校正模型建立的質量和未知樣品預測結果的準確性。可以采用扯平峰谷點、偏置扣減、微分處理和基線傾斜等方法。基線校正最常用的解決方法是對光譜進行一階微分或二階微分處理，前者主要解決基線的偏移，后者則解決基線的漂移。采用微分可以較好地凈化圖譜信息。本試驗比較了原始光譜及一階和二階微分光譜所建模型的預測效果。

2.6 數學模型預測效果的評價指標

在對未知樣本進行測定時，根據測定的光譜和校正模型的實用性判斷，確定建立的校正模型能否對未知樣本進行測定。一般在實際建模過程中把交叉驗證的決定系數R2和校正標準差（RMSEC）作為評價標準。在外部檢驗中，用決定系數R2和預測標準差（RMSEP）作為評價標準。決定系數R2越大，而校正標準差（RMSEC）和預測標差（RMSEP）越小，說明模型越可靠。

校正標準差的計算公式如下：

式（1）中：IRMSEC為校正標準差值；M為定標集的樣品數；iy^ 為第i個樣品的預測值；yi為第i個樣品的化學分析值。

預測標準差值的計算公式如下：

式（2）中：JRMSEP為預測標準差值；n為驗證集的樣品數。

決定系數R2給出了真實組分值中出現的變量百分數，預測含量值越接近真值，R2越接近100%，其計算公式如下：

式（3）中：yn為M個樣品真值的平均值。

3 結果與分析

3.1 草莓樣品可溶性固形物與糖度測定結果

草莓樣品可溶性固形物含量分析結果如表1所示。由表可知，校正集樣品中可溶性固形物范圍為9.1～17.3，標準偏差為1.857 4，平均值為11.514 6；驗證集樣品的可溶性固形物范圍為9.6～17.1，平均值為12.235 4，標準偏差為1.498 2。測定值呈典型的“鐘”形的正態分布，這表明樣品值具有較廣泛的代表性，并保證方差分析、回歸分析等統計方法所對應的樣本值服從正態分布。草莓糖度的分析結果如表2 所示。

表1 草莓樣品可溶性固形物含量分析結果

表2 草莓糖度的分析結果

3.2 不同譜區對結果的影響

在運用偏最小二乘法建立模型的過程中，選擇不同的譜區，對結果具有一定的影響。運用The uascrambler 9.6定量分析軟件將全光譜波段分成11 個交叉的波段，表3 和表4 只列舉了部分譜區，即選擇了預測效果最佳的譜區，并按效果由好到差依次列于表中。

表3 不同譜區對PLS 模型效果的影響

表4 不同譜區對PCR 模型效果的影響

結合表3 和表4，從交叉驗證后預測值和實際值的決定系數R2、校正標準差（RMSEC）以及模型預測后的決定系數R2、預測標準差（RMSEP）可以看出，總的來說PLS 對原始光譜的建模要優于PCR 對原始光譜的建模。由表3 可知，通過偏最小二乘法所得的模型，在波段為500～1 600 nm 范圍內，交叉驗證得到最大的R2和最小的RMSEC值，分別為0.995 5和0.108 1；并且用這個模型預測驗證集，所得到的R2和RMSEP值也最理想，分別為0.872 7 和0.493 2。

因此，500～1 600 nm 為PLS 建模的最適譜區。而由表4 可知，通過PCR 所得模型的最適譜區為800～1 400 nm。產生這個差異的原因尚未弄清有待進一步研究，本文不做討論。

3.3 不同光譜預處理方法對結果的影響

本試驗采用一階微分和二階微分這2 種常用的光譜預處理方法，并且比較原始光譜、一階微分光譜和二階微分光譜所建模型的預測能力。對可溶性固形物進行建模時，采用偏最小二乘法、主成分回歸法2 種不同的數學校正法，并分別在其最適譜區內建模，最后對2 種模型進行比較討論。

利用PLS 和PCR 對不同預處理光譜進行建模，預測模型結果如表5 所示，由表可知，PCR 和PLS 的預測能力有明顯差別。比較PLS 和PCR 分別基于原始光譜、一階微分光譜和二階微分光譜的模型，PLS 普遍具有較高的R2值及較小的RMSEC 值和RSMEP 值，表明PLS 法更適于草莓的建模分析。

表5 建模和預測模型結果

從分析結果來看，對樣品的原始光譜采用一階、二階微分處理后的PLS 預測模型的擬和度及預測效果有一定的差異，由好到差依次是：原始光譜、一階光譜、二階光譜。單看PLS 模型，一階光譜與二階光譜所建立的校正模型，其決定系數R2相差不大，分別為0.943 2、0.943 1，而與原始光譜相比，其決定系數R2為0.995 5，都有相對較大的差距。

再比較各種不同光譜預處理后的PCR 模型，也可以發現，基于原始光譜建立的模型效果最好，其決定系數R2為0.992 9。而一階微分、二階微分處理后預測效果大大降低，決定系數分別為0.491 1、0.216 9。

以上結果說明，原始光譜所建模型的性能最好，一階微分和二階微分處理并沒有提高模型的預測能力。對于草莓可溶性固形物的近紅外光譜檢測，原始光譜比微分光譜更適合于建模。

進行綜合比較后發現，3 種不同光譜預處理方法所得到的驗證決定系數R2、校正標準差（RMSEC）以及模型預測后的決定系數R2、預測標準差（RMSEP）都存在比較大的差別。因此，在建模過程中，要反復比較、慎重選擇，力求選擇的譜區、光譜預處理方法和建模方法為最佳搭配。

4 結論

隨著儀器和光譜處理化學計量學軟件及相應各類應用模型的開發，近紅外光譜技術作為一種快速及綠色的分析技術將會被應用在越來越多領域中。

目前，在儀器的研發方面，更加注重高信噪比、高穩定性、低檢測極限、便攜、價廉等要求；在應用方面，突出在線、實時、遠程、結果可靠等概念。因此，筆者認為在未來的研究工作中應以這些為導向，完善儀器、優化軟件，使近紅外光譜技術發揮更大的作用。