硫紅霉素菌渣有機肥對大豆土壤中耐藥菌及相關抗性基因的影響

易鴛鴦,謝 芳,田世英,張志東,顧美英,彭小武

(1.新疆環境保護科學研究院,烏魯木齊 830011;2.新疆環境污染監控與風險預警重點實驗室/新疆清潔生產工程技術研究中心/國家環境保護準噶爾荒漠綠洲交錯區科學觀測研究站,烏魯木齊 830011;3.新疆農業科學院微生物應用研究所/新疆特殊環境微生物實驗室,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】抗生素抗性基因作為一種新型環境污染物,其可通過移動基因元件在環境中遷移、轉化[1-3]。菌渣廢棄物因含有抗生素殘留會造成生態環境污染[4]。加大抗生素菌渣的無害化處理,對其后續處置的監測和評估有重要意義。【前人研究進展】抗生素菌渣除含有少量殘留的抗生素外,其粗脂肪含量占比為10%～20%,粗蛋白含量占比為30%～40%,可通過水熱處理、電子束處理、菌渣熱解、厭氧消化、好氧堆肥等技術實現菌渣資源化利用,其中,菌渣肥料化是一種重要的無害化處理途徑[5-6]?？股鼐诎l酵肥料化過程中,能有效降低其抗生素含量,施用后能有效提高土壤有機質、堿解氮、有效磷和速效鉀含量,但對菌渣有機肥施用帶來的抗生素抗性基因擴散的生態風險評價不一[7-9]。【本研究切入點】施用硫紅雷素菌渣制備的有機肥,大豆土壤真菌豐富度和優勢度顯著降低,潛在致病菌數量下降[10],但對大豆土壤耐藥菌及其抗性基因的影響,尚不清楚。需研究硫紅霉素菌渣有機肥對大豆土壤中耐藥菌及相關抗性基因的影響?！緮M解決的關鍵問題】以大豆為供試作物,設置藥渣有機肥不同施用量處理,分別檢測大豆苗期、結果期中的抗生素抗性菌數量和種類,分析不同抗生素抗性基因的豐度變化,為硫紅霉素菌渣有機肥施用后對農作物土壤的生物安全性評價提供數據基礎。

1 材料與方法

1.1 材 料

以黃豆綏農14號大豆為供試作物,以某生物制藥企業硫紅霉素菌渣無害化處理后制得的有機肥為施用肥料。

1.2 方 法

1.2.1 試驗設計

田間試驗地點為新疆某制藥企業試驗基地,試驗共設置3個處理,分別為對照組CK(不施藥渣有機肥)、A1(施用硫紅霉素菌渣有機肥500 kg/667 m2)、A2(施用硫紅霉素菌渣有機肥1 000 kg/667 m2),每個處理為1個試驗小區,各小區面積約為1 334 m2。播種前,將菌渣有機肥為底肥施入大豆土壤,取樣測定土壤樣品硫紅霉素殘留及理化性質,并按照常規進行田間管理。表1

表1 土壤中硫紅霉素殘留與土壤理化性質Table 1 Residue thioerythromycin and physical-chemical properties of different treatments soil

1.2.2 樣品采集

在大豆出苗期和結果期每個小區選取5個典型樣方,每個樣方按照“梅花五點”法布設5個分點,采集表層(0～20 cm)土壤,剔除雜質后,將土樣充分混勻后用四分法保留2 kg,采集的土樣放入裝有冰袋的采樣箱運回實驗室,在24 h內進行抗生素耐藥菌計數,剩余土壤樣品-80℃保存,備用。

1.2.3 細菌培養與計數

采用稀釋平板涂布計數法進行菌落計數,其中未加抗生素的營養瓊脂平板用于總菌數計數使用,分別以50 μg/mL的硫紅霉素、青霉素、頭孢拉定的抗性營養瓊脂平板,進行硫紅霉素、青霉素、頭孢拉定抗性菌的計數。

取10 g土壤樣品,置于100 mL無菌生理鹽水中,120 r /min 條件下振蕩10 min,靜止5 min,取1 mL土壤懸液按10倍系列稀釋后,取適宜稀釋度土壤懸液100 μL,涂布于對應平板上,作3次平行,置于30℃恒溫培養箱中培養48 h。

1.2.4 耐藥細菌鑒定

觀察不同抗性平板,挑選顏色、形態特異的菌落,于相對應抗性平板上劃線純化,30℃培養箱中恒溫培養,定期觀察,并連續純化培養,直至獲得單菌落。

采用菌落PCR方法,選用細菌16S rDNA序列通用引物27F和1 492R進行耐藥菌16S rDNA序列PCR擴增。PCR產物經天根膠回收試劑盒(TIANgel Midi Purification Kit)切膠純化后,送至生工生物工程(上海)有限公司測序,測序所得菌株序列到NCBI數據庫進行BLAST比對,確定與實驗菌株親緣關系最近的屬種。

1.2.5 ARGs篩選與擴增

選取典型耐藥基因,2種紅霉素類ARGs(ermB、ermF)、1種β-內酰胺類ARGs(blaTEM)、2種磺胺類ARGs(sul1、sul2)進行檢測,引物序列由生工生物工程(上海)有限公司合成。

土壤總DNA提取采用快速提取試劑盒(Fast DNA Spin Kit for Soil),并以此DNA為模板,以ermB、ermF、blaTEM、sul1、sul2為目的基因,參照王佳佳[11]、朱玥晗[12]方法進行PCR擴增,PCR產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測,判斷引物適用性及土壤有無相關抗性基因。表2

1.2.6 不同ARGs的qPCR標準曲線繪制

選擇1.2.5所述抗性基因序列大小正確,且特異性好的PCR條帶進行回收純化,純化后的PCR產物與pMD19-T載體連接后,轉入大腸桿菌DH5α感受態細胞,挑取單菌落接種于含50 μg/mL氨芐青霉素抗性的LB液體培養基中,37℃震蕩培養12 h后,采用天根質粒小提試劑盒(TIAN Pure Midi Plasmid Kit)提取質粒,并送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。

表 2 ARGs引物序列Table 2 Primer sequences of antibiotic resitance genes

對鑒定正確的抗性基因質粒,采用Biotek Epoch微孔板分光光度計(美國)進行濃度以及純度檢測,根據測定濃度值計算基因拷貝數[13]。質粒DNA按10倍梯度稀釋作為定量標準品反應模版,參照qPCR試劑盒(Quanti Nova SYBR Green PCR Kit)條件進行擴增,反應體系為:2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL,Forward Primers 0.25 μL,Reverse Primers 0.25 μL,QN ROX Reference Dye 2 μL,模板1 μL,ddH2O 7.5 μL。反應條件為:94℃預變性4 min,94℃,30 s;54℃,30 s;72℃,30 s;30個循環;72℃終延伸10 min。分析各基因序列在不同濃度PCR擴增的Ct值,并以拷貝數的log值為橫坐標,Ct值為縱坐標繪制標準曲線。

1.2.7 土壤ARGs的定量分析

分別以各土壤DNA為模版,開展不同基因的qPCR擴增,反應體系和反應條件同1.2.5。待qPCR擴增結束后,明確各土壤樣品qPCR擴增的Ct值,并通過標準曲線計算得到土壤樣品中目的基因的絕對含量。

1.3 數據處理

利用Excel軟件對常規數據進行整理、匯總,采用SPSS 19.0軟件對數據進行統計學分析,選用GraphPad Prism 8.0.1進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 不同處理對土壤細菌數量的影響

研究表明,大豆不同生育期可培養細菌菌落數及抗生素耐藥菌菌落數之間存在一定差異,大豆苗期土壤中各類細菌數量大于結果期菌落數。各細菌數在數量上排序為苗期A1>結果期A1,苗期A2>結果期A2。在苗期樣品中,施加了硫紅霉素菌渣有機肥的土壤細菌總數、硫紅霉素抗性菌數顯著高于對照組,土壤細菌總數為A2>A1>CK,分別為2.52×107>2.43×107>1.87×107;硫紅霉素抗性菌數為A2>A1>CK,分別為5.50×103>4.9×103>4.33×103。而青霉素、頭孢拉定抗性菌株數與對照組差異不顯著。在結果期樣品中,施加了硫紅霉素藥渣有機肥的土壤中各類菌落總數與對照組差異不顯著。表3

在苗期的土壤中,盡管硫紅霉素抗性菌總數相較于對照組顯著增加A2>A1>CK,但其相對豐度卻明顯下降A1

2.2 土壤中抗生素耐藥菌的種屬構成

研究表明,共獲得各類菌株51株,其中,硫紅霉素耐藥菌14株,青霉素耐藥菌25株,頭孢拉定耐藥菌12株。經16S rDNA序列分子鑒定,所得硫紅霉素耐藥菌株分布于11個菌屬,其中,假節桿菌屬、芽胞桿菌屬、類谷氨酸桿菌屬菌種數均為2個,其余菌屬菌種數均為1個。25株青霉素耐藥菌分布于7個菌屬,其中鏈霉菌屬菌種數最多,達到18株,占總菌株數比例高達72.00%。12株頭孢拉定耐藥菌分布于5個菌屬,其中,假單胞菌屬菌株數最多,占比達到50.00%,其次為鏈霉菌屬和芽孢桿菌屬菌。表4

表 3 不同處理下大豆不同生長期土壤中耐藥菌數量Table 3 Drug resistant bacteria in soil at different treatments and growth stages of soybean

圖1 出苗期硫紅霉素耐藥菌數相對豐度

表 4 大豆土壤中篩選獲得耐藥菌菌屬分布Table 4 Genus distribution of drug resistant bacteria isolated from soybean soil

2.3 施用有機肥后作物土壤中ARGs的水平

2.3.1 不同ARGs及16S rDNA標準曲線繪制

研究表明,分別以ermB、ermF、blaTEM、sul1、sul2為目的ARGs基因進行qPCR擴增,各擴增基因的標準曲線線性回歸方程相關系數R2均高于0.99,各基因濃度與qPCR的Ct值線性相關性較好。表5

2.3.2 土壤中ARGs絕對豐度分析

研究表明,β-內酰胺類ARGs(blaTEM)拷貝數高于紅霉素類ARGs(ermB、ermF)和磺胺類ARGs(sul1、sul2)。大豆苗期土壤中ARGs絕對含量均大于結果期。在苗期樣品中,施加了硫紅霉素菌渣有機肥的土壤其中紅霉素類ARGs(ermB、ermF)和16SrDNA拷貝數均高于對照組,但差異不顯著;β-內酰胺類ARGs(blaTEM)和磺胺類ARGs(sul1、sul2)絕對含量與對照組差異也不顯著。在結果期樣品中,硫紅霉素菌渣有機肥處理對土壤各類ARGs絕對含量影響不大,且差異不顯著。表6

表 5 抗性基因和16S rDNA標準曲線方程Table 5 Standard curve equation of ARGs and 16S rDNA

2.3.3 施用有機肥后土壤中ARGs的相對豐度

研究表明,在大豆苗期不同處理方式下土壤中ermB、ermF相對豐度存在差異,在大豆出苗期,A1和A2的ermB和ermF平均相對豐度均高于CK對照組,但三者間差異不顯著。在大豆結果期不同處理方式下土壤中ermB與ermF平均相對豐度也均高于對照組,但差異不顯著。圖2

大豆苗期土壤中β-內酰胺類blaTEM相對豐度明顯高于sul1和sul2,在不同生育期的樣品中,blaTEM、sul1和sul2相對豐度與對照組均表顯差異不顯著。圖3

表6 施用硫紅霉素菌渣大豆土壤中ARGs的拷貝數變化Table 6 Copy number of ARGs in soybean soil with thioerythromycin residue

(a)大豆出苗期土壤中ARGs相對豐度 (b)大豆結果期土壤中ARGs相對豐度

(a)大豆苗期土壤中ARGs相對豐度 (b)大豆結果期土壤中ARGs相對豐度

3 討 論

在有機肥的發酵過程中,菌渣中抗生素及相關代謝物殘留物或相關抗性基因的降解和轉化不徹底,在施用后可能會增加作物土壤中抗生素耐藥菌的數量和ARGs的含量,具有潛在的環境安全風險[14-17]。周睫雅[18]發現頭孢菌素菌渣有機肥施用對大豆土壤中的細菌豐度影響較小,且對土壤中抗性基因總相對豐度和主要抗性基因的類型影響較小。平然等[19]研究發現,硫酸新霉素菌渣有機肥施用后土壤中硫酸新霉素抗性基因acc(6′)ib相對豐度增加,但顯著低于商品有機肥。肖祖飛[20]研究發現,施用制藥污泥肥料會增加非根際土、根際土、根和青菜(蘇州青)葉際的ARGs豐度和多樣性,并推測污泥肥料施用后的土壤是葉際的ARGs的一個主要來源,施用制藥污泥肥料會增加ARGs擴散風險。我國每年產生約200多萬噸硫紅霉素菌渣[21],但硫紅霉素菌渣有機肥堆肥處理或處理后應用對土壤中ARGs污染水平研究未見報道。研究通過分析硫紅霉素菌渣無害化處理制得的有機肥施用大豆農田其土壤中常見ARGs的絕對豐度和相對豐度變化,結果表明影響不顯著。

研究結果表明,在苗期土壤樣品中,施加了硫紅霉素菌渣有機肥的土壤細菌總數、硫紅霉素抗性菌數顯著高于對照組,而青霉素、頭孢拉定抗性菌株數與對照組差異不顯著;在結果期樣品中,施加了硫紅霉素藥渣有機肥的土壤中各類菌落總數與對照組差異不顯著,與Wang等[22]在對青霉素藥渣有機肥施用后相關結果一致。

在有機肥如糞肥或者堆肥施用到土壤后,因打破了原有土壤中營養組成會出現微生物菌群快速響應,此時的ARGs的豐度會明顯提高,當不再繼續施肥時,ARGs的豐度會逐漸減少[23-24]。研究發現,在大豆苗期土壤中紅霉素類ARGs(ermB、ermF)、β-內酰胺類ARGs(blaTEM)和磺胺類ARGs(sul1、sul2)的絕對含量均大于結果期,也可能與此過程相關。研究也發現在施加有機肥不同生育期土壤樣品中,施加了硫紅霉素菌渣有機肥的土壤中紅霉素類ARGs(ermB、ermF)平均含量高于對照組,但差異不顯著,且β-內酰胺類ARGs(blaTEM)和磺胺類ARGs(sul1、sul2)含量與對照組差異也不明顯。施加硫紅霉素菌渣有機肥對土壤中常見ARGs的影響不大,但后續影響還有待進一步跟蹤開展。

4 結 論

施用不同濃度的硫紅霉素菌渣有機肥后,高濃度菌渣有機肥處理土壤中抗性菌數量高于低度濃度菌渣有機肥處理,且苗期抗性菌數量均大于結果期,但隨著大豆的生長抗性菌數量均明顯下降,并且與CK相比,硫紅霉素、青霉素、頭孢拉定的數量在大豆苗期、結果期均未明顯增加。獲得14株硫紅霉素耐藥菌菌株分布于11個菌屬,其中假節桿菌屬、芽胞桿菌屬、類谷氨酸桿菌屬菌株數占總菌株數的比例最高;25株青霉素耐藥菌菌株分布于7個菌屬,其中鏈霉菌屬菌株數最高;12株頭孢拉定耐藥菌分布于5個菌屬,其中假單胞菌屬菌株數最高占總菌株數的比例達到50.00%。施用硫紅霉素菌渣有機肥土壤中常見ARGs的絕對豐度和相對豐度有一定的影響,但影響不顯著。