巴爾喀什蘑菇子實體漆酶純化與理化特性及對酚類化合物的降解能力

努爾孜亞·亞力買買提,郝敬喆,賈文捷,陳浩宇,羅 影,賈培松

(新疆農業科學院植物保護研究所/農業農村部西北荒漠綠洲作物有害生物綜合治理重點實驗室,烏魯木齊 830091)

0 引 言

【研究意義】新疆特有大型野生食用菌巴爾喀什蘑菇,其成熟子實體埋藏在地面下30～50 cm土層內[1]。焉耆縣博斯騰湖區的蘆葦灘由于特定的生態環境,適宜該菇的生存,該菇子實體生長在紅柳和蘆葦根部腐質層中,5月和10月為子實體形成期,成熟的子實體個體形態差異較大。目前該野生菇未能實現人工栽培繁育。真菌漆酶是一種含銅離子的多酚氧化酶,能降解木質素,去除許多酚類物質的毒性,研究巴爾喀什蘑菇子實體的生物學特性、漆酶理化性質及對酚類化合物的降解能力具有重要意義。【前人研究進展】食用菌分類上通常采用形態學與ITS區序列測定等方法鑒定種屬關系[2]。巴爾喀什蘑菇以蘆葦、紅柳等植物纖維素和木質素為菌體生長發育提供小分子營養物質和能源[3],而木質素降解依賴真菌漆酶反應活性高低,酶的催化活性強弱在一定程度上決定真菌菌絲對培養料的生物轉化率[4]。漆酶是一種含銅的多酚氧化酶,廣泛存在于自然界的多種植物和菌類的分泌物中,催化酚類或芳胺類等多種底物[5]。漆酶反應活性常受溫度、pH值和金屬離子濃度變化產生促進或抑制作用[6]。【本研究切入點】巴爾喀什蘑菇栽培馴化過程中,漆酶活性高低是提高產量的重要環節,需研究巴爾喀什蘑菇漆酶的蛋白質結構和自身的理化特性,挖掘該漆酶對木質素等物質分解效率。【擬解決的關鍵問題】以采集的博湖縣黑蘑菇通過ITS區PCR擴增比對,結合子實體形態鑒定為巴爾喀什蘑菇。抽提該蘑菇子實體漆酶為研究對象,對其進行分離純化,得到漆酶分子大小、N端結構,并對其催化底物、要求的溫度、pH值、金屬離子促進抑制率等理化性質進行研究,得到該酶活性范圍和最大利用率。

1 材料與方法

1.1 材 料

采自新疆博湖縣博斯騰湖周邊野生蘑菇巴爾喀什菇子實體。

1.2 方 法

1.2.1 菌絲體培養

將采集的野生蘑菇子實體表面消毒,取髓部組織置于新鮮PDA試管斜面培養基中央,置于25℃培養箱中培養3 d;從純化好的PDA斜面培養基上,再次用滅菌的接種針鉤取前端菌絲移入新鮮PDA斜面培養基中間,置于25℃培養箱中培養,待菌絲長滿斜面后放在4℃冰箱保存。

1.2.2 菌種鑒定

(1)形態學鑒定參照菌物學分類文獻的方法[7];(2)ITS鑒定:依據DNA提取試劑盒的方法提取真菌子實體基因組DNA。通用引物ITS1:TCCGTAGGTGAACCTGCGG和ITS4:TCCTCCGCTTATTGGATATGC。PCR 擴增條件:94℃,預變性5 min;94℃,變性30 s,50℃,退火45 s,72℃延伸,100 s,循環30 次;72℃延伸5 min。PCR 產物經0.8%的瓊脂糖凝膠140 V,電泳1 h,按膠回收試劑盒說明書回收PCR 產物。將膠回收產物送上海生工生物技術公司測序,將獲得的堿基序列提交GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov)數據庫,采用在線軟件BLAST 進行堿基序列比對分析,利用MEGA 5.0 系統進化樹的構建。

1.2.3 子實體漆酶抽提

取50 g新鮮子實體500 mL 10%NaCl去離子水溶液4℃勻漿液過夜,浸提12 h,8 000 r/min離心10 min,取上清液即為粗酶液,4℃冰箱保存。測酶活力。

1.2.4 漆酶活性的測定

將10 μL漆酶樣品和190 μL底物ABTS溶液混合均勻,置于30℃水浴5 min反應,迅速加入300μL 3.8%HClO4終止反應,8 000 r/min離心5 min后取上清于420 nm測定吸光度,對照組用10 μL去離子水代替漆酶樣品。每個測定條件設3個平行,數據結果取平均值。酶活定義:在30℃下,以每分鐘氧化1 μmol 的ABTS 所需要的酶量定義為1 個酶活力單位,酶活性以U/mL 表示。參照文獻的方法[8],計算公式如下:

1.2.5 漆酶的純化

依照1.2.3方法提取上清液。上清液首先經2.5 cm × 20 cm的CM-cellulose陽離子交換柱分離純化,該柱預先使用10 mmol/L NaAc-HAc緩沖液 (pH 4.5) 平衡,用同樣的NaAc-HAc緩沖液和分別含0.2、0.5及1.0 mmol/L NaCl的NaAc-HAc的緩沖液洗脫,收集漆酶活性組分,再使用10 mmol/L Tris-HCl 緩沖液 (pH 7.2) 平衡過的陰離子交換柱Q-Sepharose (1 cm × 10 cm) 進一步分離, 分別使用緩沖液和0～1 mmol/L NaCl梯度洗脫后, 得到活性組分, 透析后用Superdex 75 HR 10/30凝膠過濾層析柱經快速蛋白液相系統AKTA Purifier (GE Healthcare) 進行分子篩分離 (0.2 mmol/L NH4HCO3, pH 8.5),凍干活性組分。送上海生工生物技術公司進行蛋白質質譜鑒定。

1.2.6 漆酶酶學性質

最適反應溫度:漆酶酶促反應的時間均定為10 min。根據酶活測定方法,分別測定4、10、20、30、40、50、60、70、80和90℃,10 個不同溫度下,酶促反應10 min 后的酶活,以等體積的蒸餾水代替酶液為空白對照,將各溫度下測得漆酶的酶活,以最高酶活力計為100%, 計算相對酶活力;

最佳pH :配制不同pH 值(4～10)的緩沖液,在30℃溫度下測定不同pH 值對酶活力的影響,以等體積的蒸餾水代替酶液為空白對照,反應10 min 后用300 μL 5%TCA終止反應,測定酶活;

金屬離子對酶活的影響:配制終濃度為5、2.5和1.25 mmol/L 的不同金同的金屬離子(K+、Ca2+、Cu2+、Fe2+、Mg2+、Zn2+),取10 μL 金屬離子溶液加入到190 μL ABTS緩沖溶液中測定其漆酶活力,以添加等量去離子水為對照組。定義對照組酶活為100%,計算各金屬離子影響下漆酶的相對酶活,用相對酶活表示金屬離子對酶活的影響。

底物多樣性對漆酶的催化特性影響:配制咖啡酸、沒食子酸、甲苯胺、聯苯胺、鄰苯二酚、2,6二甲氧基酚、愈創木酚、對苯二酚和ABTS等終濃度為5 mmol/L的不同底物濃度溶液,取10 μL漆酶樣品加入到190 μL底物緩沖溶液中混合均勻,25℃水浴反應10 min,用300 μL 5% TCA終止反應,分別測定各底物在最大吸收波長下的吸光值,每組做3個重復。以添加等量去離子水為對照組。定義活性最高組酶活為100%,計算各反應底物影響下漆酶的相對酶活。

1.3 數據處理

利用SPSS Statistic 20.0(www.ibm.com/software/analytics/spss)對所得數據進行單因素方差檢驗(One - way ANOVA)。

2 結果與分析

2.1 野生蘑菇(巴爾喀什)子實體形態學鑒定

研究表明,子實體個體較大,多為單生或散生。菌蓋半球形,直徑8～20(40)cm,后平展,中央平或稍凹陷,具有纖維質尖端翹起的鱗片,淡褐黃色;菌肉結實質密,厚度3～6 cm,刨開創面初為淡紅色,逐漸變為紅色-紫紅色-褐色-黑色,離生或彎生;菌褶密,不等長;菌柄長7～25(47) cm,粗3～6(9) cm,中生,近圓柱形,基部膨大彎曲;菌環雙層,上層在菌柄上部,寬大,淡褐色,下層菌環窄小。孢子印黑褐色,擔子棍棒形,著生擔孢子2～4個。圖1

注:a.巴爾喀什菇湖畔生境;b.地下30 cm處子實體;c.子實體形狀;d.孢子印;e.單孢子和孢子梗(10×40X);f.菌絲形態

2.2 野生巴爾喀什菇TS基因序列及系統發育分析

研究表明,將DNA 進行膠回收,并送生物技術公司測序,得到BHBC ITS基因的PCR 擴增產物片段長度為697 bp。將ITS基因序列與GenBank 數據庫中的序列進行同源性比對,BHBC與A.balchaschensis(HQ446468)的基因序列自然聚類。選出9株與BHBC ITS基因序列同源性達99%的基因序列。BHBC 與A.sinodeliciosus(KM657914.1),A.subperonatus(KX505304.1),A.desjardinii(KM657906.1)聚為一簇,相似性也最高,為99.5%,BHBC與A.balchaschensis的親緣關系最近。圖2

圖 2 BHBC 基因PCR 擴增產物電泳檢測(左)基于ITS基因序列相似性的菌株的系統進化樹(右)

2.3 野生巴爾喀什菇子實體漆酶純化

研究表明,得到巴爾喀什蘑菇子實體活性組分SU1。得到電泳純的漆酶,酶的比活力由粗提物的0.048 U/mg 提高到17.02 U/mg,純化倍數為354.58。表1

表1 野生巴爾喀什菇漆酶純化變化Table 1 Results of laccase purification from A. balchaschensismushroom

2.4 野生巴爾喀什菇漆酶N-端氨基酸序列的分子量

研究表明,純化的漆酶在Superdex 75分子篩過濾。計算其分子量為65 kDa,漆酶N端的氨基酸序列為SGGPEQNTTA,與以前分離的蘑菇漆酶部分氨基酸殘基有明顯的相似性。與Pleurotusostreatuslaccase和Phlebiaradiatalaccase包涵SXGP同源序列,與BasidiomycetePM1laccase、CeriporiopsissubvermisporalaccaseI、Lepistanudalaccase、Pycnoporuscinnabariuslaccase、Russulavirescens、TrametesversicolorlaccaseI、TrametesversicolorlaccaseII、TrametesversicolorlaccaseIII和Tricholomamongolicumlaccase等包涵XXGP同源序列。表2

2.5 野生巴爾喀什漆酶理化性質

研究表明,該菌株的最適溫度為40℃,當溫度為4℃時,仍有活性。在4～50℃,隨著溫度升高,酶活力增加,在50℃時,酶活力達到最大值,達到51.65 U/mL,當溫度超過50℃,酶活開始急劇下降,BHBC子實體漆酶屬于中低溫酶。圖3

漆酶活力隨著pH 值的升高而降低,pH 2.2超后,酶活力下降,pH 4.5有小波動,子實體漆酶的最適反應pH 值為2.2,屬于酸性漆酶。在pH 2～9 均有活性。圖4

表2 野生巴爾喀什蘑菇漆酶蛋白質 譜與其他已報道的漆酶相似性比對Table 2 N-terminal sequence comparison ofAgaricus balchaschensis laccase and other mushroom laccases

圖3 不同溫度下巴爾喀什蘑菇漆酶活性變化

圖4 不同pH下巴爾喀什蘑菇漆酶活性變化

除Cu2+對漆酶活性的有促進作用外,幾乎所有的金屬離子對漆酶活性均有抑制作用,伴隨溶液中離子濃度的降低抑制力逐漸減弱,中低濃度變化相對不大。Cu2+對漆酶活性的5 mmol/L濃度時的相對酶活為105.35%,相對Hg2+離子的抑制作用最大,高濃度5 mmol/L的相對酶活為6.94%,低濃度1.25 mmol/L的抑制率是12.21%; 5 mmol/L時的相對酶活是91.35 %;Mg2+、Mn2+、Pb2+和Cu2+離子在低濃度時的抑制作用比中濃度略有增加。表3

蘑菇漆酶對不同底物的降解活性有較大的差異。對ABTS的降解活性最高,甲苯胺和對苯二酚活性較高分別是15.77%和34%,對咖啡酸、沒食子酸、鄰苯二酚、2,6二甲氧基酚和愈創木酚活力較低。表4

表3 不同金屬離子下漆酶活性變化Table 3 Effect of metal ions rate of laccase from A. balchaschensis (%)

3 討 論

采自焉耆縣野生蘑菇巴爾喀什菇子實體的菌環呈兩層、雙環結構,明顯區別于雙胞菇和大肥菇,菌蓋初期卵球形,后變平展,污白色,表面光滑或有鱗片;菌髓白色受傷遇空氣變紅色;菌褶初期白色后變成紅褐色,菌肉厚與黑傘屬菌的特征高度符合[9],與文獻中描述巴爾喀什蘑菇的特征一致[8]。基因測序分析發現,野生蘑菇 (巴爾喀什)的ITS區序列與美味蘑菇(A.sinodeliciosusKM657914.1)、赭鱗蘑菇(A.subperonatus(KX505304.1)、A.desjardinii(KM657906.1) 菌株的同源序列覆蓋率為99.5% 。野生蘑菇BHBC基因與A.balchaschensis的同源覆蓋率達99.9%,系統發育樹在同一節點,親緣關系最近[10]。結合形態特征,該菌株BHBC為巴爾喀什蘑菇[8]。

野生巴爾喀什菇純化后子實體漆酶為65kD單亞基蛋白,真菌漆酶的分子量一般在50～90 kD之間,符合擔子菌漆酶[11]。 擔子菌漆酶的N 端氨基酸序列具有很大的相似性[12],采自焉耆縣野生巴爾喀什菇漆酶的N端氨基酸序列包括Ser、Gly 和Phe等氨基酸,與BasidiomycetePM1laccase、Pleurotusostreatuslaccase和Phlebiaradiatalaccase均包含SxGP序列相似度高[13]。

通常真菌漆酶的最適酶活反應pH 范圍為3.5～6,最適作用溫度為30～50℃,過高或過低的溫度都會抑制漆酶活性[14]。研究得到的巴爾喀什蘑菇子實體漆酶pH值是2.2,最適溫度40℃。較研究報道的大多數漆酶pH低,如云芝栓孔菌(Trametesversicolor)所產漆酶的最適 pH為3.8[15],多孔菌(Polyporus)為4.2[16],硬毛粗蓋孔菌(Funaliatrogii)為6.0[17]。該漆酶屬酸性活性漆酶,酸性環境適應性高于一般漆酶。金屬離子耐受實驗表明,所有種金屬離子對該酶具有抑制作用,Cu2+對漆酶活性的有微弱的促進作用,與大多數漆酶研究結論相同,證明銅離子是漆酶活動中心。Zhuo 等[18]研究了幾種金屬離子對 P. ostreatus HAUCC 162 漆酶活性有所增加,其中Cu2+效果最為顯著。 Hg2+抑制蘑菇漆酶作用最強,在濃度為5 mmol/L時酶活僅存6.94%,漆酶活性。鐵離子、銀離子及汞離子通常抑制漆酶的活性[19]。

蘑菇漆酶可以催化多種底物,代謝底物中對ABTS的催化作用最強,其次對苯二氧基酚和甲苯胺等苯環類物質。漆酶介導生物體內酚類物質氧化偶聯合成降解木質素和黃酮類物質參與物質交換[20]。

4 結 論

4.1焉耆縣采集的黑蘑菇是蘑菇屬的巴爾喀什蘑菇,是一種大型野生食用菌。子實體漆酶通過硫酸銨沉淀、纖維素CM-cellulose陽離子、Q-Sepharose陰離子交換吸附純化和Superdex 75凝膠過濾層析,得到純化倍數為354.58倍,回收率是1.5%,分子量為65 kDa的單亞基蛋白。該漆酶N端的10個氨基酸序列為: SGGPEQNTTA,與糙皮側耳和雜色云芝漆酶有相似中心。

4.2巴爾喀什蘑菇子實體漆酶具有較低的pH, 達2.2,最適溫度為40℃,屬于中低溫性漆酶。金屬離子Cu2 +對該漆酶對ABTS有輕微促進作用,Hg2 +對它有很強的抑制作用。該漆酶可以催化氧化多種底物,由強到弱主要有ABTS>二甲氧基酚>甲苯胺。