高效液相色譜-串聯質譜法檢測雞蛋中多西環素藥物殘留

張 美，朱莉莎，徐飄飄，曾 婧，向文婷，歐亞紅，梁繼翔，彭大鵬

（1.武漢工控檢驗檢測有限公司，武漢 430030；2.華中農業大學動物科學技術學院動物醫學院，武漢 430070）

四環素類是由鏈霉菌產生的一類價格低廉、抗菌活性高的廣譜抗菌素，包含四環素、土霉素、金霉素、多西環素（Doxycycline）、強力霉素、脫氧土霉素等［1］。其中，多西環素廣譜高效且價格低廉，是蛋雞養殖中使用較多的四環素類藥物，主要用于大腸桿菌病、沙門氏菌病、慢性呼吸道疾病等疾病的防治［2，3］。為保障食品安全，2019 年農業農村部聯合國家衛生健康委員會和國家市場監督管理總局發布了食品中獸藥最大殘留限量的食品安全國家標準，規定了四環素類在家禽的肝、腎、皮膚和肌肉的最大殘留限量分別為300、600、300、100 μg/kg，蛋雞產蛋期禁止使用相關藥物［4］。

雞蛋營養豐富且價格低廉，是人類重要的動物源性食品［1］。在蛋雞的飼養過程中部分養殖戶在經濟利益的驅動下沒有規范使用獸藥、飼料和墊料等，雞蛋中藥物殘留超標的事件時有發生，造成食品安全隱患［5］。楊歡春等［6］研究報道，2016—2017 年寧夏回族自治區市售雞蛋和雞肉樣品抽檢中均發現了四環素藥物類抗生素殘留超標。孫言鳳等［7］研究發現，2016—2018 年湖北省抽檢的538 份雞肉和雞蛋樣品中多西環素殘留超標率達12.8%。2012 年歐盟多國獸藥殘留監測均發現有多西環素殘留超標的現象［8］。

國內外報道了多種用于檢測動物源性食品中多西環素殘留的檢測方法，如高效液相色譜法［9-11］和液相色譜-串聯質譜（HPLC-MS/MS）方法［12，13］。此類檢測方法多集中于豬肉、雞肉、魚肉等動物可食性組織［14］。本研究以食品安全關注度高的雞蛋為材料，探究建立了一種檢測雞蛋中多西環素藥物殘留的靈敏度高、重現性好、操作便捷的HPLC-MS/MS檢測方法，為快速、靈敏地檢測雞蛋中多西環素藥物的殘留提供參考。

1 材料與方法

1.1 試藥

乙腈（色譜純）、甲醇（色譜純）、甲酸（色譜純）、乙二胺四乙酸二鈉（Na2-EDTA）、NaOH、NaH2PO4、檸檬酸和草酸均購自中國醫藥集團有限公司；多西環素（DOTC）標準品購自中國獸醫藥品監察所；雞蛋市售；去離子水。試驗于2018年11月至2019年5月進行。

1.2 主要儀器

SHIM AD ZU20A 型高效液相色譜儀，日本島津公司；HH 型恒溫水浴鍋，湖北琴臺醫療器械廠；TGL-16B 型冷凍高速離心機，上海菲恰爾分析儀器有限公司；N-EVAPTM111 型氮吹儀，美國路易公司；CPA225D 型分析天平，賽多利斯科學儀器有限公司；API5000 型三重四級桿質譜儀，美國Applied Biosystems 公司；WX-80A 型旋渦混合器，北京六一儀器廠；KQ3200 型超聲波清洗機，昆山市超聲儀器有限公司。

1.3 試劑配制

1.3.1 Na2HPO4溶液的配制 準確稱取Na2HPO471.63 g，加去離子水溶解，定容于1 000 mL 容量瓶中，得到0.2 mol/L Na2HPO4溶液。

1.3.2 0.1 mol/L 檸檬酸溶液配制 準確稱取檸檬酸21.01 g，加去離子水溶解，定容于1 000 mL 容量瓶中，得到0.1 mol/L 檸檬酸溶液。

1.3.3 Na2-EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液 取625 mL的0.2 mol/L Na2HPO4溶液加入1 000 mL 0.1 mol/L 檸檬酸溶液中，混合均勻，用稀HCl 或NaOH 調節pH至4.0±0.05；準確稱取60.50 g Na2-EDTA 加入其中，充分攪拌使其溶解。

1.3.4 多西環素儲備液 用甲醇將多西環素配成濃度為1 mg/mL 的標準儲備液，-20 ℃避光保存，有效期為2 個月。

1.4 樣品制備

取適量的新鮮雞蛋去殼，混勻后于-20 ℃下保存備用。

1.4.1 提取 準確稱取均質后的雞蛋樣品1.00 g 置于10 mL 離心管中，加入1.5 mL Na2-EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液，渦旋1 min，再加入4.5 mL 乙腈溶液，振蕩10 min；室溫條件下超聲振蕩15 min，4 ℃條件下10 000 r/min離心10 min，取上清液于新的10 mL離心管中，得到空白基質溶液。

1.4.2 凈化 選擇相應的固相萃取柱無需活化，取“1.4.1”制備的上清液3 mL 過柱，收集濾液于10 mL離心管中，40 ℃水浴條件下氮氣吹干，再用初始比例的流動相溶液作為復溶液0.5 mL 溶解，經0.22 μm濾膜過濾，取過濾液待后續試驗。

取6 份空白雞蛋樣品，經提取純化后，加入適量的多西環素標準儲備液，制成濃度分別為0、0.5、1.0、2.0、5.0 μg/kg 和10.0 μg/kg 的基質匹配標準溶液上機檢測，繪制基質匹配標準曲線，得到回歸方程和相關系數。

1.5 色譜條件

色譜柱為Waters Acquity Uplc BEH C18（2.1 mm ×50 mm，2.5 μm），固相萃取柱為waters prime HLB 200 mg/6 mL，濾膜為0.22 μm，流速為0.2 mL/min，進樣量為10 μL；流動相A 相：0.1%甲酸水溶液；B 相：乙腈。梯度洗脫程序見表1。

表1 多西環素梯度洗脫條件

1.6 質譜條件

電噴霧離子源（ESI）模式：正離子電離模式（ESI+）掃描，多離子反應監測（MRM）模式，離子源溫度250 ℃，霧化氣流速3.0 L/min，加熱氣流速10.0 L/min，加熱模塊溫度400 °C，干燥氣流速10.0 L/min，氬氣17.0 kPa，其他多西環素質譜參數如表2 所示。

表2 多西環素質譜參數

1.7 線性范圍的確定

分別用甲醇和空白基質溶液稀釋多西環素儲備液，得到多西環素濃度為10.0、5.0、2.0、1.0、0.5 μg/kg的標準工作液，待上機檢測。

1.8 準確度與精密度

在空白基質溶液中加入多西環素標準儲備液，分別制備多西環素濃度為10.0、3.0 μg/kg和1.0 μg/kg的添加樣品，按上述處理步驟進行殘留測定。將測定濃度與藥物理論添加濃度進行比較，得到藥物添加回收率，每個添加水平平行測定6 次，得到其相對標準偏差。以回收率表示方法的準確度，相對偏差表示精密度。

2 結果與分析

2.1 線性范圍的確定

標準溶液標準曲線和雞蛋基質匹配標準曲線分別為y= 137 782x+152 808 和y= 135 699x+150 714（圖1）。二者線性范圍均在0.5～10.0 μg/L，相關系數R2均大于0.990 0。可見樣品基質影響較小，可以直接通過標準溶液曲線計算回收率。

圖1 多西環素標準溶液曲線與雞蛋基質匹配曲線

2.2 檢測限與定量限

空白基質溶液中添加藥物后經試驗得到特征離子色譜信噪比，本方法實際檢測限為0.5 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg。

2.3 準確度與精密度

在3 個加標水平上，多西環素的平均回收率為85.4%～93.1%，平均相對標準偏差（RSD）小于15%（表3）。結果表明，本方法回收率較高，重復性好。

表3 多西環素在雞蛋樣品中的回收率

3 討論

3.1 色譜柱的選擇

不同的色譜柱對藥物的保留時間會有不同，預試驗對已經報道的Waters Acquity Uplc BEH C18［15］和Hypersll GOLD C18［16］色譜柱進行比較，發現Waters Acquity Uplc BEH C18 對多西環素的分離度更好，響應值更高。因此，本研究選擇Waters Acquity Uplc BEH C18 色譜柱。

3.2 流動相的選擇

流動相體系會影響樣品分離的效果。參考文獻［17-19］，預試驗分別比較了磷酸-甲醇、甲酸-甲醇、三氟乙酸-甲醇、磷酸-乙腈、甲酸-乙腈和三氟乙酸-乙腈這6 種不同流動相體系。結果表明，甲酸-乙腈為流動相時梯度洗脫效果最佳，能夠很好地解決色譜峰拖尾現象，保留時間良好，柱壓也較低。因此，本研究選擇甲酸水-乙腈作為流動相，同時在最初的梯度中保持較高的水相比例，使目標物得以充分保留。

3.3 提取試劑的選擇

四環素類藥物屬于酸堿兩性物質［20］，其在弱酸性溶液中較為穩定，在堿性、中性或強酸性溶液中均易與金屬離子、蛋白質絡合［11］。卜曉娜等［14］研究表明，Na2-EDTA-Mcllvaine 緩沖液為弱酸性溶液，提取四環素類藥物效果較好。此外，還有采用按比例混合的甲醇乙酸水［21］、0.01 mol/L Na2-EDTA 溶液和0.3%磷酸溶液［22］等作為提取液的報道。由于雞蛋中富含蛋白質及磷脂，故本研究采用乙腈和Na2-EDTA-Mcllvaine 緩沖液作為提取液，當有機相比例達80%時，達到了最佳提取效果。

3.4 凈化條件的優化

因動物組織中含有大量蛋白質、脂肪等物質，為了避免對色譜儀器的損害以及減少雜質的干擾，通常需要對目標分析物進行凈化。預試驗比較了MAX、HLB、prime HLB、C18 和液液萃取的凈化效果［11，18，23］。結果表明，液液萃取處理方法相對簡單，但樣品回收率不穩定、回收率低，不能滿足要求。本研究選用Waters prime HLB 固相萃取柱，無需活化，提取凈化方便，回收率及穩定較高，可以滿足本試驗要求。

4 小結

本研究成功建立了雞蛋中多西環素藥物殘留檢測的高效液相色譜-串聯質譜法。本方法樣品前處理簡單，檢出限為0.5 μg/kg，定量限為1.0 μg/kg；準確度好，回收率為85.4%～93.1%；精密度高，相對標準偏差為6.3%～13.5%，可以滿足雞蛋中多西環素殘留檢測的要求。