Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)法優(yōu)化商陸鮮制飲片工藝

王海燕，陳 重，余春生，楊俊杰

（1.信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院制藥工程學(xué)院，河南 信陽(yáng) 464000；2.武漢禾元生物科技股份有限公司，武漢 430074）

商陸為商陸科植物商陸（Phytolacca acinosaRoxb.）或垂序商陸（Phytolacca amerrcanaL.）的干燥根［1］，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，是一種應(yīng)用歷史悠久的中草藥，有逐水消腫、通利二便、解毒散結(jié)的功能。商陸藥材在獸用方面有廣泛的用途，特別是用于家禽類(lèi)泌尿系統(tǒng)感染方面［2］。現(xiàn)代藥理研究表明，不同商陸提取物均能降低血清UA、Cr、腎組織NO 水平及腎指數(shù)，對(duì)雞腎腫癥有較好的治療效果［3］。商陸總皂苷對(duì)癌性腹水模型小鼠具祛腹水作用［4］，商陸皂苷甲對(duì)哮喘小鼠氣道炎癥有緩解作用［5］，抑制Aβ誘導(dǎo)的原代小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)［6］，為商陸的有效成分，也是商陸質(zhì)量評(píng)價(jià)的指標(biāo)性成分。

商陸為多年生草本，根莖肥大，干燥后切片困難，故在產(chǎn)地采收過(guò)程中，通常把商陸切成厚片或段，便于干燥，再加工成不同規(guī)格飲片，干燥方法［7］和不同飲片［8］所含化學(xué)成分及藥理效應(yīng)有顯著差異。商陸藥材在加工成飲片的過(guò)程中，由于產(chǎn)地加工片過(guò)厚，不利于調(diào)劑，需要重新潤(rùn)濕，薄切，干燥。產(chǎn)地加工環(huán)節(jié)和炮制環(huán)節(jié)的重復(fù)操作，會(huì)造成有效成分的損失；另外商陸藥材貯藏運(yùn)輸過(guò)程中，極易霉變，影響藥材質(zhì)量和用藥安全。將中藥材產(chǎn)地加工與中藥炮制一體化（“一體化”工藝），從鮮藥材直接加工成飲片，以減少中間重復(fù)環(huán)節(jié)，可以保證中藥飲片質(zhì)量。楊俊杰等［9，10］對(duì)商陸產(chǎn)地加工和炮制的現(xiàn)代研究進(jìn)展進(jìn)行系統(tǒng)梳理，但有關(guān)商陸鮮制飲片的具體操作工藝及系統(tǒng)加工參數(shù)未見(jiàn)報(bào)道，趁鮮切制工藝方面的研究尚屬空白。

本試驗(yàn)采用商陸總皂苷和商陸皂苷甲含量的綜合評(píng)分為評(píng)價(jià)指標(biāo)，運(yùn)用Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)法，考察商陸鮮品切制厚度、干燥溫度、干燥時(shí)間3個(gè)因素的交互影響，確定商陸的鮮制飲片加工工藝，以期為商陸飲片的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

Agilent1100 型高效液相色譜儀（VWD 紫外檢測(cè)器，Agilent 化學(xué)工作站），購(gòu)自美國(guó)安捷倫科技有限公司；UV1901 型紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)，購(gòu)自北京普析通用有限公司；電子分析天平，購(gòu)自瑞士梅特勒公司。

1.2 主要藥品與試劑

商陸于2021 年11 月在信陽(yáng)市平橋區(qū)丘陵坡地采挖，經(jīng)信陽(yáng)農(nóng)林學(xué)院周巍副教授鑒定為商陸科植物垂序商陸的新鮮根莖；商陸皂苷甲對(duì)照品（HPLC≥98%，批號(hào)為ZY151023），購(gòu)自上海譜振生物科技有限公司；葡萄糖對(duì)照品（批號(hào)為GBW10062），購(gòu)自中國(guó)計(jì)量科學(xué)院；乙腈為色譜純；試驗(yàn)用水為去離子水，其他試劑均為分析純。

1.3 商陸總皂苷的測(cè)定

1.3.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取商陸皂苷甲對(duì)照品適量，用甲醇配制成濃度為1.98 mg/mL 的對(duì)照品溶液。

1.3.2 供試品溶液的制備 取商陸粗粉約4 g，精密稱(chēng)定，加95%乙醇80 mL，用索氏提取器連續(xù)回流6 h。減壓濃縮至10 mL，取出，加入5 g 硅藻土拌勻，于水浴鍋上揮干。將殘?jiān)糜?00 mL 錐形瓶中，加50 mL 用水飽和的正丁醇，超聲提取40 min，過(guò)濾，將濾液減壓濃縮至干，用少量甲醇溶解殘?jiān)?0 mL 容量瓶定容，過(guò)濾，取續(xù)濾液1 mL，用甲醇定容至10 mL，即得。

1.3.3 線(xiàn)性范圍考察 精密移取商陸皂苷甲對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，加甲醇補(bǔ)足至1.0 mL，加入8%香草醛乙醇溶液0.5 mL，77%硫酸8.5 mL，60 ℃水浴恒溫保持10 min，再置冰水浴中15 min。用紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)于450 nm 處測(cè)定吸光度（A），以吸光度對(duì)濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到回歸方程A=3.354 2C+0.130 6（r=0.999 5）。結(jié)果表明，商陸皂苷甲在0.019 8～0.198 0 mg/mL 濃度范圍與吸光度線(xiàn)性關(guān)系良好。

1.3.4 精密度試驗(yàn) 精密移取對(duì)照品溶液1.0 mL，按“1.3.3”方法顯色、測(cè)定吸光度6 次，結(jié)果RSD為1.32%，表明儀器精密度良好。

1.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密移取供試品溶液1.0 mL，按“1.3.3”方法顯色，顯色后每隔5 min 測(cè)定1 次，共7次。結(jié)果RSD為1.61%，表明該供試品溶液顯色后30 min 內(nèi)穩(wěn)定。

1.3.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次商陸樣品6 份，按“1.3.2”供試品溶液制備方法和“1.3.3”顯色方法，分別測(cè)定計(jì)算總皂苷含量，結(jié)果RSD為1.37%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.3.7 加樣回收率試驗(yàn) 取商陸樣品（總皂苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.762%）約2.0 g，共6 份，精密稱(chēng)定，分別加入商陸皂苷甲對(duì)照品約10 mg，測(cè)定樣品中總皂苷含量，由表1 可知，平均回收率為99.85%，RSD為1.46%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

表1 商陸總皂苷加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

1.4 商陸皂苷甲的含量測(cè)定

1.4.1 色譜條件 PM 952505-C18 色譜柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm），以含甲酸（0.1%）的乙腈為流動(dòng)相A，0.1%甲酸溶液為流動(dòng)相B，按照表2 所示方法進(jìn)行梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm，柱溫30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，理論塔板數(shù)按商陸皂苷甲計(jì)不低于3 000。

表2 商陸皂苷甲含量測(cè)定梯度洗脫條件

1.4.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱(chēng)取商陸皂苷甲對(duì)照品5.2 mg，用甲醇定容至10 mL 容量瓶，制得濃度為0.52 mg/mL 的商陸皂苷甲對(duì)照品溶液。

1.4.3 供試品溶液的制備 取商陸粗粉約2 g，精密稱(chēng)定，置50 mL 具塞錐形瓶中，精密加入50%甲醇20 mL，稱(chēng)重，超聲處理（500 W，40 kHz）40 min，放冷，用50%甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液得。

1.4.4 線(xiàn)性關(guān)系考察 精密吸取“1.4.2”對(duì)照品溶液，分別進(jìn)樣3、6、9、12、15 μL 注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測(cè)定，以峰面積的積分值（A）為縱坐標(biāo)、對(duì)照品進(jìn)樣量（m）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得到回歸方程A=1.430 2m+9.311 8（r=0.999 8），表明商陸皂苷甲在1.56～7.80 μg 線(xiàn)性關(guān)系良好。

1.4.5 精密度試驗(yàn) 精密吸取0.52 mg/mL 商陸皂苷甲對(duì)照品溶液進(jìn)樣20 μL，重復(fù)進(jìn)樣5 次，以峰面積計(jì)算RSD，RSD為1.70%，表明該儀器精密度良好。

1.4.6 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取商陸樣品粗粉約2 g，精密稱(chēng)定，按“1.4.3”方法制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、12、24 h 測(cè) 定 商 陸 皂 苷 甲 含 量，結(jié) 果RSD為0.36%，表明該方法在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

1.4.7 重復(fù)性試驗(yàn) 取商陸樣品粗粉2 g，按“1.4.3”方法制備供試品溶液，平行試驗(yàn)6 份，結(jié)果樣品中商陸皂苷甲含量的RSD為1.42%，表明該方法重復(fù)性良好。

1.4.8 加樣回收試驗(yàn) 精密稱(chēng)取已知含量（0.473%）的商陸粗粉共6 份，每份約0.5 g，分別加入商陸皂苷甲對(duì)照品約2 mg，按“1.4.3”方法制備供試品溶液，測(cè)定商陸皂苷甲含量，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)表3，平均回收率為100.74%，RSD為1.31%，表明該方法準(zhǔn)確可靠。

表3 商陸皂苷甲加樣回收試驗(yàn)結(jié)果

1.5 綜合評(píng)分方法

《中華人民共和國(guó)藥典》（2020 年版）規(guī)定商陸的指標(biāo)性成分為商陸皂苷甲，以干燥品計(jì)算，不得少于0.15%。商陸的有效成分主要為商陸總皂苷，加工過(guò)程中會(huì)伴有商陸皂苷的轉(zhuǎn)化，影響到商陸皂苷甲的含量。故將商陸皂苷甲和商陸總皂苷作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，綜合考慮。指標(biāo)評(píng)分具體公式如下。

式中，X為總皂苷含量（%），Xmax為正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)9 組試驗(yàn)中總皂苷含量的最大值，Y為商陸皂苷甲含量（%），Ymax為商陸皂苷甲含量的最大值。

1.6 單因素考察

1.6.1 切片厚度考察 商陸在產(chǎn)地加工過(guò)程中，為方便干燥保存，一般切成5 cm 左右的厚片，待飲片廠收購(gòu)后再重新潤(rùn)透、薄切，以利于調(diào)劑使用。本試驗(yàn)選擇的切片厚度分別為1、3、5 mm。取新鮮商陸用多功能切藥機(jī)按照上述厚度切片，分別取3 份樣品，于55 ℃干燥，粉碎后進(jìn)行測(cè)定。

1.6.2 干燥時(shí)間選擇 切片越厚，干燥需時(shí)越長(zhǎng)。因此選擇5 mm 片作為考察干燥時(shí)間的樣品厚度，在不同溫度下35、45、55、65、75 ℃干燥，分別于不同時(shí)間點(diǎn)2、4、8、12、16 h 取樣、粉碎，測(cè)定含量。

1.6.3 干燥溫度選擇 取新鮮商陸，切3 mm 厚片，分別取3 份于35、45、55、65、75 ℃下干燥。取飲片粉碎，過(guò)二號(hào)篩，測(cè)定各指標(biāo)含量。

1.7 Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

選擇切片厚度（A）、干燥溫度（B）、干燥時(shí)間（C）3 個(gè)因素作為自變量，以商陸總皂苷、商陸皂苷甲含量2 個(gè)指標(biāo)的綜合評(píng)分為效應(yīng)值，根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面設(shè)計(jì)原理，運(yùn)用3 因素3 水平的響應(yīng)面設(shè)計(jì)法進(jìn)行分析。在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，確定Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)因素水平見(jiàn)表4。

表4 試驗(yàn)因素水平

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素考察結(jié)果

2.1.1 切片厚度考察結(jié)果 切片厚度考察結(jié)果如表5所示。結(jié)果表明，當(dāng)商陸飲片厚度增大時(shí)，商陸總皂苷、商陸皂苷甲含量明顯增加，在3 mm 時(shí)各指標(biāo)性成分含量較高，且片形較好，不易造成碎片，因此選擇3 mm 作為考察水平。

表5 切片厚度對(duì)商陸有效成分含量的影響

2.1.2 干燥溫度考察結(jié)果 干燥溫度考察結(jié)果如表6所示。在55 ℃時(shí)，商陸飲片指標(biāo)性成分的含量都較高，且干燥時(shí)間較短，適于大量生產(chǎn)，因此，商陸飲片于55 ℃下干燥較為合適。

表6 干燥溫度對(duì)商陸有效成分含量的影響

2.1.3 干燥時(shí)間考察結(jié)果 不同干燥溫度、干燥時(shí)間條件下，商陸水分含量、總皂苷含量、皂苷甲含量見(jiàn)表7。對(duì)商陸烘干過(guò)程考察發(fā)現(xiàn)，高溫條件75 ℃下干燥8 h，藥材含水量小于13.0%，符合《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定，低溫條件35 ℃干燥16 h，同樣能達(dá)到要求。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，干燥時(shí)間延長(zhǎng)會(huì)造成商陸有效部位和有效成分的損失。綜合考慮本試驗(yàn)設(shè)定干燥時(shí)間為12 h。

表7 干燥時(shí)間對(duì)商陸水分及有效成分含量的影響

2.2 Box-Behnken 響應(yīng)面設(shè)計(jì)

將試驗(yàn)結(jié)果輸入Design Expert 8.06 軟件，得試驗(yàn)結(jié)果如表8 所示。

表8 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果

2.3 回歸模型的建立與分析

用Design Expert 8.06 軟件對(duì)表8 結(jié)果進(jìn)行二次多元回歸擬合，得到回歸模型為R1=95.19-0.80A+2.47B+1.13C-0.63AB+1.42BC-1.07A2-5.72B2-6.45C2。

對(duì)回歸模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果如表9 所示。由表9 可知，該模型P＜0.01，表明本回歸模型差異極顯著，試驗(yàn)設(shè)計(jì)可行，誤差較小。失擬項(xiàng)P＞0.05，差異不顯著。經(jīng)可信度分析，校正決定系數(shù)為0.884 8，信噪比為10.648 0，遠(yuǎn)大于4。表明使用該方程擬合效果較好，其他因素對(duì)試驗(yàn)結(jié)果干擾較小，因此，可以用該方程確定商陸鮮制切片的最佳工藝參數(shù)。由試驗(yàn)結(jié)果可知，干燥溫度（B）及其二次方的P均較小，表明其對(duì)商陸切制工藝的影響較顯著。3 因素對(duì)綜合評(píng)分的影響為干燥溫度＞干燥時(shí)間＞切片厚度。三者的交互等高線(xiàn)以及響應(yīng)面曲線(xiàn)見(jiàn)圖1。響應(yīng)曲面越陡峭，說(shuō)明該因素對(duì)綜合評(píng)分的影響越顯著；響應(yīng)曲面平緩，則說(shuō)明該因素對(duì)綜合評(píng)分的影響不顯著。結(jié)合表9 和圖1 可知，切片厚度與干燥時(shí)間的交互作用對(duì)綜合評(píng)分的影響極顯著；切片厚度與干燥溫度、干燥溫度與干燥時(shí)間的交互作用對(duì)綜合評(píng)分的影響不顯著。

表9 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)結(jié)果方差分析

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化及驗(yàn)證

由Design Expert 8.06 軟件得到商陸切片的最佳提取條件為厚度2.58 mm、干燥溫度54.11 ℃、干燥時(shí)間9.57 h。在此條件下，綜合得分為96.00%。考慮到實(shí)際操作，將最佳工藝條件修正為厚度3 mm，干燥溫度55 ℃，干燥時(shí)間10 h。按照所得參數(shù)條件，加工3 批商陸飲片，分別測(cè)定商陸總皂苷和商陸皂苷甲含量后，計(jì)算得到綜合評(píng)分為95.21%±0.63%，與預(yù)測(cè)值十分接近，表明本試驗(yàn)確定的優(yōu)化工藝結(jié)果可靠，具有一定的實(shí)用價(jià)值。

3 小結(jié)與討論

《中華人民共和國(guó)藥典》收錄的商陸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中，規(guī)定測(cè)定的指標(biāo)性成分為商陸皂苷甲，既是其有效成分，又是其毒性成分，但商陸的生物活性是多種皂苷綜合作用的結(jié)果，同時(shí)，加工炮制過(guò)程中，存在不同皂苷的結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，故在本試驗(yàn)設(shè)計(jì)中，對(duì)商陸皂苷甲和總皂苷的含量作綜合分析，使試驗(yàn)設(shè)計(jì)更加科學(xué)。工藝研究過(guò)程中，Box-Behnken 響應(yīng)面法既可以減少單因素交叉試驗(yàn)的繁瑣，又較傳統(tǒng)的正交試驗(yàn)減少人為因素對(duì)結(jié)果的影響，特別是能反映出各因素之間的交互作用變化，使試驗(yàn)結(jié)果更加合理。由于樣品采集的局限性，試驗(yàn)所用批量較小，需進(jìn)一步中試和擴(kuò)大生產(chǎn)驗(yàn)證。商陸屬于多年生藥材，生長(zhǎng)年限和采收時(shí)節(jié)是否會(huì)對(duì)成品飲片的質(zhì)量造成影響，尚待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)研究表明，商陸鮮制飲片加工過(guò)程中，影響因素為干燥溫度＞干燥時(shí)間＞切片厚度，其中干燥溫度影響顯著，切片厚度和干燥時(shí)間交互影響極顯著。優(yōu)化工藝為厚度3 mm，干燥溫度55 ℃，干燥時(shí)間10 h。本試驗(yàn)從技術(shù)層面驗(yàn)證了商陸產(chǎn)地加工與炮制一體化工藝的可行性，可為今后的商陸飲片生產(chǎn)提供參考。