犢牛腹瀉隱孢子蟲病診斷技術分析

胡書梅，薛永康，劉文思，李陽光，趙玉璽，何文章，張 震

（1.河南花花牛畜牧科技有限公司，河南新鄉 453000；2.河南省奶牛生產性能測定有限公司，鄭州 450002；3.河南省種業發展中心，鄭州 450002）

犢牛腹瀉又稱犢牛拉稀，是胃腸道的消耗性疾病［1］。該病可引起犢牛生長緩慢、生產性能下降，甚至死亡，治療費用高，治愈率低，導致牛養殖業經濟效益損失嚴重［2］。引起腹瀉的原因較復雜，隱孢子蟲是主要的病原，有較高的檢出率［3］。隱孢子蟲病也是人畜共患病，對生物安全造成了較大的威脅［4，5］。眾多學者已在隱孢子的方法建立和亞型分析方面作出了較大的貢獻。

1 犢牛腹瀉隱孢子蟲病發生情況

1.1 病原學

隱孢子蟲病（Cryptosporidiosis）是由隱孢子蟲感染引發的水樣腹瀉寄生蟲病，蟲體寄生在動物呼吸道黏膜或胃腸道上皮細胞［6，7］，是導致奶牛和免疫缺陷病人腹瀉的常見病原［8］。據報道，隱孢子蟲的10 多個基因型和蟲種有感染人類的風險，其中微型隱孢子蟲常在人或動物腸道中被檢出［6］。

隱孢子蟲病流行于世界各地，由隱孢子蟲感染家畜而導致的損失不可估量，尤其是犢牛感染后可引起嚴重腹瀉、體型消瘦甚至影響后續生產性能，給畜牧業的發展帶來了嚴重的經濟損失。

1.2 流行情況

隱孢子蟲不分季節發病，但是溫暖潮濕環境更適合其生存［8］。全世界100 多個國家或地區（包括中南美洲、大洋洲、北美洲、歐洲、亞洲和非洲等）均有隱孢子蟲病的報道［9，10］。隱孢子蟲病在中國也普遍存在，且不同月齡的犢牛感染率不同，一般情況下牛隱孢子蟲感染率隨著年齡增長而降低，病癥也會減弱，不同品種的感染率也不相同。

1.3 發病機理和臨床癥狀

細胞骨架異常是微小隱孢子蟲感染胃腸上皮細胞后的改變，導致柱狀上皮細胞和絨毛膜的萎縮，腸道功能受損，引起腹瀉［11，12］。部分犢牛感染隱孢子蟲后不表現出癥狀，部分表現為嚴重食欲下降、腹瀉、脫水等癥狀，但不能與其他病原導致的腹瀉區分開。營養性腹瀉也有明顯的消瘦癥狀，易誤診。戶外飼養的比室內飼養消耗多，易引起營養不良、身體消瘦等癥狀［13］。

1.4 傳染源傳播途徑

隱孢子蟲病可依靠多種路徑傳播，最主要的傳播方式是糞口傳播［14］。犢牛感染后，在5～28 d 不斷外排隱孢子蟲卵，造成周邊環境污染，包括空氣、飼料和水源［15］。健康牛通過接觸攜帶蟲卵的糞便、被污染的飼料和環境導致隱孢子蟲擴散。患病牛是隱孢子蟲病主要的傳染源［16］。人類隱孢子蟲病也可通過被污染的水源和患病動物進行傳播［15］。

2 隱孢子蟲病常見的診斷方法

隱孢子蟲病的檢測方法較多，分別從傳統檢測方法和新開發的檢測方法入手，介紹隱孢子蟲病的常見實驗室診斷方法。

2.1 糞便學

漂浮法是隱孢子蟲糞便學的主要測驗方法。其原理主要是利用比重不同的液體，隱孢子蟲卵因比重小而集中漂浮在液體表面，通過離心可收集大量的原蟲蟲卵。常用的方法如表1 所示。與其他2 種方法相比，蔗糖離心浮聚法檢出率和回收率相對較高，但由于蔗糖溶液黏性大，導致卵囊與雜質的分離程度低，限制了卵囊的純度［17］。常見隱孢子蟲種的卵囊指數見表2。

表1 常用的富集蟲卵方法及比重

光學顯微鏡油鏡下檢查，經染色的卵囊排列雜亂無章。在整個藍綠色的視野中，清晰可見圓形或橢圓形的玫瑰紅色蟲卵囊，直徑大小為4～6 μm；顏色深、月牙狀的是子孢子。

2.2 免疫學檢查

酶聯免疫吸附試驗（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）在規模養殖場使用較成熟，是常用的免疫學診斷技術，相比其他檢測技術具有設備需求不高、批量檢測、準確性好等特點［18］。因此，國內外研究者廣泛應用ELISA檢測犢牛腹瀉隱孢子蟲。

Brar 等［19］建立了ELISA 檢測方法，并在印度北方地區開展相關檢測，約有35%的腹瀉隱孢子蟲感染；Viring 等［20］對瑞典部分地區開展腹瀉犢牛樣本檢測，發現隱孢子蟲屬檢出率在6.1%左右。

ELISA 方法在國內外被廣泛應用于動物疫病檢測（包括隱孢子蟲），使用最多的是美國IDEXX 的ELISA 檢測試劑盒。由于成本較高，且特異性強，導致現有商品化ELISA 試劑盒大多只能檢測微小隱孢子蟲（高純度抗原制備困難），在牧場、基層實驗室推廣緩慢。

2.3 聚合酶鏈式反應檢測技術（PCR）

生物檢測技術不斷進步，常見的常規PCR、實時熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qPCR）、巢式PCR、數字PCR（Digital PCR，dPCR）可用于病原的檢測。

2.3.1 常規PCR 該方法是最基礎的PCR 方法，通過設計出特定病原保守序列的一對上下游引物，然后從樣品核酸中擴增對應片段，最后通過測序確定病原種屬。Gomez 等［21］設計了牛冠狀病毒特異性引物，并對樣本進行測試。

2.3.2 巢式PCR 巢式PCR 需要針對目標片段設計2 對引物，因此需要進行兩輪反應，而且第二輪反應將使用第一輪反應的擴增產物作為模板。Silverlas等［22］建立了隱孢子蟲巢式PCR 反應體系，不僅可以對樣本中隱孢子蟲進行檢測，還可以進行基因鑒定。

2.3.3 qPCR qPCR 區別于其他PCR，主要是需要設計探針。qPCR 具有靈敏度好、特異性強、自動化程度高等優勢，與其他PCR 方法相比，可以避免電泳檢測，減少了核酸染料（EB）對人的傷害［23］。Cho等［24］設計出一套5 種病原（包括微小隱孢子蟲）聯檢的多重qPCR 方法，該方法與普通PCR 方法相比，檢出率在88.5%～96.8%，且特異性和敏感性都優于普通PCR。

2.3.4 dPCR dPCR 已在分子診斷過程中廣泛應用，是絕對定量的檢測技術。相較于qPCR，dPCR 能直觀測出DNA 分子數量。但是缺少效果好的隱孢子蟲dPCR 市售試劑盒產品。

與 普通PCR 和巢 式PCR 相比，qPCR 具有 準 確性高、操作簡便等特點；與dPCR 相比，qPCR 具有價格低的優勢。綜合考慮，在不進行絕對定量的前提下，qPCR 可以在腹瀉病原檢測過程中作為及時有效的診斷方式。

2.4 環介導等溫擴增檢測技術（LAMP）

LAMP 是被很多學者應用于病原診斷的一種新型擴增技術，具有用時短、特異性高等特點，其最突出的優勢是可以在恒溫條件下（63±3 ℃）進行擴增。史亞東［25］基于LAMP 技術建立了快速從糞樣中檢測微小隱孢子蟲的檢測方法，通過臨床驗證后具有較好的特異性。LAMP 易發生非特異性擴增和氣溶膠污染，是制約該技術在基層獸醫實驗室推廣的原因［26］。

2.5 基因芯片技術

基因芯片技術在人遺傳缺陷病和特定病原檢測中已有使用［27，28］，該技術具有操作簡便、較高的準確性、多病原同時檢測和易于推廣等優勢，但也存在一些劣勢，比如技術成本高、重復性較差、受限于儀器設備等。有部分科研院所已在動物疫病檢測中應用該技術。該技術在犢牛腹瀉病原診斷中的應用值得期待。

2.6 重組酶聚合酶擴增（RPA）

RPA 技術是新興的擴增技術，可能替代常規PCR 新技術。該技術最大的優勢是可在37 ℃左右的等溫條件下完成擴增，且擴增過程10～20 min 就能完成，降低了核酸擴增對儀器設備的條件限制，適合用于實驗室診斷和現場診斷。RPA 已在金黃色葡萄球菌、芽孢桿菌、衣原體等病原檢測方面廣泛運用，但是還未在犢牛腹瀉病原檢測領域應用。

3 討論

犢牛腹瀉病病原復雜，存在單獨感染和多病原混合感染，癥狀較為相似，臨床上很容易造成誤診，病牛常因為得不到及時診斷和有效的治療，造成較大的經濟損失。微小隱孢子蟲既是牛腹瀉重要病原，也是隱藏的人畜共患病病原，免疫力低的人員（老人和兒童等）與攜帶病原犢牛接觸后，有一定感染風險，因此針對隱孢子蟲的早期鑒別診斷對犢牛腹瀉的防治較為重要。

隨著檢測技術的發展，越來越多的先進技術將被應用到動物疫病檢測，希望隱孢子蟲檢測手段日趨改進，為隱孢子蟲病的診斷提供支撐。