藤苦參組培快繁技術

肖 明，胡琦敏，龐曉云，陳曉藝，譚安薔，李清平，羅宇東

（1.廣西中醫藥大學百年樂制藥有限公司，南寧 530023；2.廣西中醫藥研究院，南寧 530022）

藤苦參又名馬蓮鞍、古羊藤、南苦參、地苦參等，系蘿藦科杠柳亞科馬蓮鞍屬植物馬蓮鞍（Streptocaulon griffithiiHook.f.），多產于廣西壯族自治區、云南省、貴州省，生長于山野坡地、山谷疏林中或路旁灌木叢中。藤苦參的干燥根入藥，可用于治療痢疾、濕熱腹瀉、心胃氣痛、感冒發燒、慢性腎炎、跌打等疾病［1-3］。作為廣西中醫藥大學百年樂制藥有限公司的獨家產品外感風痧系列產品的主藥材，藤苦參的生產需求大，為保證藥材的來源及產量，需要進行大面積人工種植。本研究在種子繁殖基礎上開展組培繁殖，探索不同植物生長調節劑對藤苦參無菌苗不定芽增殖、生根等的影響，篩選出適宜藤苦參種子萌發條件及組培繁殖培養基配方，以期為藤苦參種質資源的保護和開發利用提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試材料

藤苦參種子為野外采集，由廣西中醫藥大學中藥鑒定室鑒定為蘿藦科杠柳亞科馬蓮鞍屬植物馬蓮鞍的種子。

1.2 試驗方法

1.2.1 外植體滅菌 將藤苦參果莢未開裂的果實用自來水沖洗，在超凈工作臺上，將清洗過的果莢置于培養皿中，切開果莢取出種子，用75%乙醇浸泡20 s，無菌水沖洗1 次，加0.1%升汞，浸泡12 min，用無菌水沖洗4～5 次，備用。

1.2.2 培養基制備 添加不同濃度的6-芐氨基腺嘌呤（6-BA）和萘乙酸（NAA）、30 g/L 食用蔗糖、1 g/L活性炭、7 g/L 瓊脂，滅菌前pH 6.5，配置分裝后，在121°C 溫度下滅菌20 min。

1.2.3 培養條件 培養室溫度（25±2）℃，光照度1 000～1 200 lx，每天光照12 h。

1.2.4 種子萌發培養 將種子播種于MS 培養基中，添加不同濃度的植物生長調節劑、1 g/L 活性炭，20 d后觀察種子的萌發情況。

1.2.5 叢生芽分化培養 將種子萌發培養獲得的芽苗接種于不同的叢生芽分化培養基中，以MS 為基本培養基，比較不同濃度的6-BA 和NAA 對藤苦參芽增殖分化的影響，40 d 后觀察芽的增殖分化情況。

1.2.6 生根壯苗培養 當幼苗高在3～4 cm 時便可轉接到生根壯苗培養基中，以MS 為基本培養基，添加NAA1.0 mg/L，添加活性炭和不添加活性炭對比試驗，觀察生根壯苗后幼苗的葉片數量、葉片長度、根數及根長。

1.3 數據處理

試驗數據采用Excel軟件進行處理和計算。

2 結果與分析

2.1 不同濃度植物生長調節劑對藤苦參種子萌發的影響

將藤苦參種子播種在種子萌發培養基中，20 d統計種子萌發率，觀察種子萌發情況。從表1 可以看出，當不添加任何植物生長調節劑時，種子萌發率偏低，隨著6-BA 濃度的升高，種子萌發率逐漸增加。當NAA 濃度為0.5 mg/L 時，種子萌發率相對較高；當NAA 濃度為1.0 mg/L 時，種子萌發率相對較低；當6-BA 濃度分別為1.0 mg/L 和1.5 mg/L，NAA濃度為0.5 mg/L 時，種子萌發率均為100%，芽生長較壯。因此，最適合藤苦參種子萌發的培養基為MS+1.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA+1 g/L 活性炭或MS+1.5 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA+1 g/L 活性炭。藤苦參種子萌發生長情況如圖1 所示。

表1 MS 培養基中不同濃度植物生長調節劑對藤苦參種子萌發的影響

圖1 藤苦參種子萌發情況

2.2 不同濃度植物生長調節劑對藤苦參芽誘導的影響

將藤苦參芽接種于叢生芽培養基中培養，40 d統計芽的增殖數。從表2 可以看出，當6-BA 濃度在0～3.0 mg/L 時，隨著濃度的升高，芽的增殖數量增多，且芽的長勢較好；當6-BA 濃度達4.0 mg/L 時，分化的芽數開始下降；其中11 號培養基芽的分化數量最多。相同6-BA 濃度的情況下，NAA 濃度為0.5 mg/L 時，分化的芽數相對較多。因此，最適合藤苦參叢生芽分化的培養基為MS+3.0 mg/L 6-BA +0.5 mg/L NAA。藤苦參叢生芽分化具體生長情況見圖2。

表2 不同濃度植物生長調節劑對藤苦參芽誘導的影響

圖2 藤苦參叢生芽分化情況

2.3 活性炭對藤苦參生根壯苗的影響

將每天光照時間增加至14 h，植株生長旺盛，莖粗葉綠。生根培養50 d 后可長出2～4 條根，幼苗高為6～8 cm。由表3 和圖3 可知，添加活性炭的生根培養基中幼苗生長較壯，因此，最適合藤苦參生根壯苗的培養基為MS+1.0 mg/L NAA+1 g/L 活性炭。

圖3 藤苦參生根壯苗情況

表3 活性炭對藤苦參生根壯苗的影響

3 小結與討論

藤苦參為蘿藦科植物，已有同科其他植物組織培養研究的報道［4-9］，但未見藤苦參組織培養的報道。同科其他植物的組織培養外植體選用的是種子、莖尖、子葉、葉片等，藤苦參莖及葉均具有乳汁，且密被絨毛，在選擇外植體的時候考慮到外植體取莖尖不易滅菌，且其本身受傷會釋放乳汁影響外植體接種到培養基后的存活率等，所以，本研究選取種子作為外植體，可提高滅菌率，從而提高存活率。

藤苦參種子萌發培養中，當6-BA 濃度分別為1.0 mg/L 和1.5 mg/L，NAA 濃度為0.5 mg/L 時，種子萌發率為100%，芽生長均較壯，因此，在實際生產過程中，考慮到成本的因素，采用1.0 mg/L濃度的6-BA更合適。

在組織培養中，植物生長調節劑和生長素的合理搭配是達到最佳培養效果的關鍵，本研究中藤苦參叢生芽分化增殖培養采用了較高濃度的6-BA 和較低濃度的NAA 配合使用，這與高山林等［3］對藤苦參同科植物的組織培養研究結果相符。

培養基中添加活性炭在植物組織培養中較常見，在植物生根培養過程中，適當增加光照時間有利于幼苗生根，但強光直接照射根部會抑制根的生長，所以在生根壯苗培養基中添加活性炭可提供生根的暗環境，防止褐變；活性炭還可以吸附植物生長過程中釋放的一些有害物質，因此，本研究中在生根壯苗培養階段添加活性炭，幼苗生長較壯。