一株鴕鳥源新城疫病毒對雞胚的毒力特性初探

謝 洋，曹紫夢，郜道玉，湯學超，唐瑞林，唐春燕，王家鄉(xiāng)，李 鵬

（長江大學動物科學學院，湖北荊州 430025）

新城疫（Newcastle disease，ND）是由新城疫病毒引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染疾病，主要發(fā)病特征是呼吸困難、嚴重下痢、黏膜和漿膜出血，病程稍長的伴有神經(jīng)癥狀［1］。新城疫成為中國鴕鳥養(yǎng)殖中危害較大的傳染?。?］，對鴕鳥的健康養(yǎng)殖影響巨大［3］，特別是從2017 年以后，鴕鳥新城疫頻發(fā)，給廣大鴕鳥養(yǎng)殖戶造成了巨大的經(jīng)濟損失。在防控鴕鳥新城疫的臨床實踐中，于2019 年從河北省某鴕鳥養(yǎng)殖場送檢的具有新城疫典型臨床癥狀的1 日齡雛鴕鳥體內(nèi)分離到1 株野毒株，通過試驗確定該野毒株為新城疫強毒株。

1 材料與方法

1.1 病料來源

具有新城疫典型臨床癥狀的病雛鴕鳥1 只，來源于河北省某鴕鳥養(yǎng)殖場，為送檢樣品。

1.2 試驗材料

9～11 日齡SPF 雞胚、3 日齡健康雛雞，均購自湖北省荊州市川店鎮(zhèn)峪口禽業(yè)有限公司；雞紅細胞、新城疫陽性血清及其他試劑儀器等均由長江大學動物科學學院實驗室提供。

1.3 病毒的分離和鑒定

1.3.1 病毒的分離 取患病鴕鳥腦、肝、脾和十二指腸等病變組織加入PBS 溶液等體積混合并研磨勻漿。離心取上清液接種到10 枚9 日齡的SPF 雞胚，0.2 mL/只，置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育，24 h 后照蛋并去除死胚，繼續(xù)孵化，照蛋取死胚放置在4 ℃冰箱，36 h后取出全部雞胚并放置在4 ℃冰箱內(nèi)過夜，在無菌條件下提取尿囊液備用。

1.3.2 血清學鑒定 將提取的雞胚尿囊液與1%雞紅細胞按照經(jīng)典的免疫學試驗方法進行血凝試驗，測定其血凝活性。用實驗室提供的標準新城疫陽性血清與雞胚尿囊液進行血凝抑制試驗。

1.4 毒力指數(shù)的測定

1.4.1 雞胚平均死亡時間（MDT）測定 將雞胚尿囊液稀釋10 倍，每個稀釋度經(jīng)尿囊腔接種10 只9 日齡SPF 雞胚，每只接種0.1 mL，同時另設(shè)10 只9 日齡SPF 雞 胚接種0.1 mL 無菌PBS 溶 液作為 對 照。37 ℃孵育，棄去24 h 內(nèi)死亡的雞胚，每隔2 h 照蛋1 次，連續(xù)觀察120 h，觀察記錄雞胚死亡時間。使所有雞胚死亡的最高稀釋度就是最小致死量（MLD）。MDT是MLD致死雞胚的平均時間，強毒株為40～60 h，中毒株為60～90 h，弱毒株為90 h 以上。MDT按下列公式計算：MDT=（X時死亡雞胚數(shù)×X時+Y時死亡雞胚數(shù)×Y小時+Z時死亡雞胚數(shù)×Z時+……）/死亡雞胚總數(shù)。

1.4.2 3 日齡雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）測定 將雞胚尿囊液稀釋10 倍，腦內(nèi)接種10 只3 日齡SPF 雛雞，每只接種0.1 mL，同時另設(shè)10 只9 日齡SPF 雞胚接種0.1 mL 無菌PBS 溶液作為對照。所有雛雞置溫箱內(nèi)隔離飼養(yǎng)8 d，每天觀察并記錄雛雞的生理狀況，按照正常得0 分，患病得1 分，死亡得2 分，累計病雞數(shù)和死亡雞數(shù)的積分。ICPI是3 日齡雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)，根據(jù)OIE 提供的毒力鑒定分型標準：ICPI達0.2～0.6，為溫和型（弱毒株），0.5～1.0 為中等毒力型，1.5～2.0 為速發(fā)型（強毒力型）。ICPI按下列公式計算：ICPI=（累積死亡雞數(shù)×2+累積發(fā)病雞數(shù)×1）/雞的累積總數(shù)。

1.4.3 半數(shù)致死量（ELD50）的測定 將該病毒溶液用生理鹽水連續(xù)稀釋10 倍至10-9～10-5，并將每個稀釋的溶液用9 日齡的非免疫雞胚尿囊腔接種，每個雞胚接種0.2 mL 病毒液，每個稀釋度組中接種5個雞胚，封蠟后在37 ℃培養(yǎng)箱中溫育。每天觀察雞胚的狀態(tài)，丟棄24 h 內(nèi)死亡的雞胚，并且每天觀察2次，直到72 h。記錄雞胚死亡。然后根據(jù)Reed-Muench 法［4］計算ELD50。

2 結(jié)果與分析

2.1 血清學鑒定結(jié)果

將分離保存的尿囊液進行血凝和血凝抑制試驗。結(jié)果顯示，該毒株能夠凝集1%雞血紅細胞，而且其血凝特性能夠被新城疫標準陽性血清抑制。根據(jù)此結(jié)果可確定該分離到的毒株為新城疫病毒，暫命名為NDV-HB2019 株。

2.2 雞胚平均死亡時間（MDT）的測定結(jié)果

由表1 可知，能夠使雞胚全部死亡的最高稀釋倍數(shù)為10-7，且在36 h 時死亡的雞胚數(shù)為1 枚，48 h時死亡的雞胚數(shù)為2 枚，60 h 時死亡的雞胚數(shù)為2枚，以上的數(shù)據(jù)用公式計算可以得出雞胚平均死亡時間MDT為50.4 h。

表1 MDT 的測定結(jié)果

2.3 3 日齡雞腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）測定結(jié)果

由表2 可知，雞胚尿囊液對雛雞有很強的致死作用，死亡率較高；對照組注射生理鹽水后全部正常存活。根據(jù)國際上ICPI的計算公式可得ICPI為1.71。

表2 ICPI測定結(jié)果

2.4 半數(shù)致死量（ELD50）的測定結(jié)果

從表3 可知，測定的ELD50在10-8～10-7，按照數(shù)據(jù)并結(jié)合Reed-Muench 方法計算ELD50可得每0.2 mLELD50為5×10-7.4。

表3 ELD50的測定結(jié)果

3 討論

新城疫是由新城疫病毒引起的一種急性高接觸性傳染病，又被稱作“亞洲雞瘟”，作為被OIE 規(guī)定必須予以報告的疫病是嚴重危害養(yǎng)禽業(yè)的重要疾病。薛應(yīng)照等［5］、尹燕博等［6］研究發(fā)現(xiàn)，有的患病鴕鳥會出現(xiàn)頸部扭轉(zhuǎn)、彎曲并出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，排出黑色稀糞等癥狀。研究者分析發(fā)現(xiàn)，剖解時可以觀察到氣管和喉頭黏膜有出血點、腺胃水腫、乳頭有出血點、肌胃角質(zhì)層易脫落、角質(zhì)層下有出血點或出血斑、小腸黏膜嚴重滲出性出血、結(jié)腸和直腸的黏膜有出血點、心包外膜可見有噴灑狀出血、大腦和小腦表面血管充血、腦出血等病理變化［7-10］。本試驗中觀察到該病雛鴕鳥頸部扭轉(zhuǎn)、彎曲并出現(xiàn)神經(jīng)癥狀，內(nèi)部解剖特征與孫矗等［7］的研究報道一致，為鴕鳥新城疫的快速診斷提供了臨床依據(jù)。

NDV 根據(jù)不同致病菌株感染的家禽的不同表現(xiàn)形式可分為3 種致病類型［11，12］：速發(fā)型（強毒株）的菌株，對所有年齡段的易感禽造成急性感染性死亡；中發(fā)型（中毒株）的菌株中，只在易感幼禽引起致命感染；緩和型，低毒或無毒菌株，輕度呼吸道感染的臨床表現(xiàn)或腸道感染，無臨床癥狀。NDV 的毒力測定需根據(jù)雞胚平均死亡時間（MDT）、3 日齡雞胚腦內(nèi)接種致病指數(shù)（ICPI）和6 周齡雞靜脈接種致病指數(shù)（IVPI）及半數(shù)致死量（ELD50）的測定。

由于新城疫病毒不同分離毒株的毒力不同，判定毒力大小常用的毒力測定指標MDT、ICPI、IVPI有時并不完全一致，所以在這3 種判定指數(shù)中，需2 種或2 種以上指標綜合分析才能判定毒株的致病性強弱［13，14］。判斷新城疫病毒強毒株毒力的國際通用標準是MDT為30～60 h，ICPI＞1.6。在本試驗中測得MDT為50.4 h，ICPI為1.71，每0.2 mLELD50為5×10-7.4，符合強毒型毒株判定標準，故根據(jù)試驗結(jié)果可以判定本次分離的NDV-HB2019 株為強毒株，為下一步對其進行分子生物學特性研究和疫苗候選株篩選打下了基礎(chǔ)。