基于葉綠素熒光分析的油菜響應低溫脅迫機制研究

燕輝

摘要：為探明油菜幼苗葉綠素熒光響應低溫脅迫的生理機制，將油菜幼苗進行低溫脅迫處理，研究低溫脅迫處理下油菜幼苗葉片的葉綠素熒光參數及其光響應曲線的變化特征。結果表明，脅迫處理后油菜幼苗葉片的最大光化學效率（Fv/Fm）與激發能捕獲效率（F'v/F'm）較對照顯著降低；實際光化學效率（F'q/F'm）在低溫脅迫5～10 d后較對照顯著降低，光化學淬滅（F'q/F'v）在低溫處理1、3 和10 d后較對照無顯著變化，由此表明，低溫脅迫使PSⅡ反應中心受損，導致反應中心捕獲激發能的效率降低；此時雖然反應中心吸收的光能中用于光合電子傳遞的份額未發生顯著變化，但光能轉化效率在低溫脅迫5和10 d后較對照顯著降低。此外，F'q/F'v光響應曲線較對照變幅較小；但低溫脅迫5～10 d后，F'v/F'm與F'q/F'm光響應曲線較對照大幅降低；非光化學淬滅（non-photochemical quenching，NPQ）光響應曲線中各熒光值亦在高光強環境中顯著升高。綜上所述，長期低溫與高光強條件下，PSⅡ反應中心通過升高NPQ的光保護機制來耗散過量激發能。以上結果為進一步分析作物響應低溫脅迫的生理機制奠定了基礎。

關鍵詞：油菜；低溫脅迫；熒光參數；熒光曲線doi：10.13304/j.nykjdb.2021.0486

中圖分類號：S311；S565.4 文獻標志碼：A 文章編號：10080864（2023）01005807

油菜（Brassica napus L.）是我國重要的油料作物，在全國各地廣泛種植。目前，我國種植的油菜品種大多數都需要越冬。因此，油菜幼苗在生長過程中易遭遇低溫。低溫會對油菜幼苗生長發育造成不利影響。研究發現，在氣溫為-3 ℃時，油菜會受到嚴重傷害；隨著氣溫的進一步降低，油菜遭受的損傷更加嚴重[1]，裸露于地表的葉片最易遭受低溫傷害。低溫傷害首先導致葉肉細胞內結冰，從而對其細胞器造成生理損傷；低溫傷害還會引起葉肉細胞生理脫水及進一步的細胞塌陷，從而對其細胞質和細胞壁造成傷害。目前，低溫已成為威脅油菜幼苗正常生長的主要災害。

光合作用是農作物生長發育過程中重要的生命活動，為探明油菜光合響應低溫脅迫的生理機制，長期以來，廣大學者對低溫處理下油菜葉片的氣孔開度、光合能力與蒸騰強度等的變化規律進行了大量研究，并獲得了一些研究結果[2-4]。但是，這些傳統的指標僅能反映光合作用“表觀性”，無法反映低溫脅迫下油菜光合器官的“內在性”特征。葉綠素熒光分析是以作物光合器官所激發的葉綠素熒光變化為探針來研究不同環境條件下光合器官對光能吸收、傳遞、利用與耗散規律的無損傷檢測技術[56]。與通過分析作物葉片CO2釋放來獲取光合碳同化信息的傳統光合機理研究相比，能夠有效地反映光合器官的“內在性”特征，具有迅速、靈敏等特點[78]。因此，為分析油菜幼苗響應低溫脅迫的光合生理機制，本研究利用葉綠素熒光來探求油菜幼苗葉片在低溫條件下的熒光參數變化規律，以期為探明作物低溫響應機制提供理論指導。

1 材料與方法

1.1 試驗設計

試驗在河南科技大學農業裝備工程學院的實驗室中進行。試驗前將供試油菜種子播種于裝滿基質（通用型營養土，養分含量分別為：全氮0.68%、P2O5 0.27%、K2O 0.36%）的營養缽，并放入光照培養箱中培養，培養條件為：晝夜時長12 h/12 h，光照強度200 μmol·m-2·s-1，晝夜溫度23 ℃/19 ℃，相對濕度70%。待油菜種子出土并生長至幼苗期，開始進行試驗。試驗設置為兩組：對照組繼續在上述條件的光照培養箱中培養；脅迫處理組在低溫光照培養箱中培養，培養條件為：晝夜時長12 h/12 h，光照強度200 μmol·m-2·s-1，晝夜溫度6 ℃/2 ℃，相對濕度70%。兩組均保持相同的水分供應，分別于低溫處理的第1、3、5和10天使用葉綠素熒光儀測定油菜葉片各熒光參數及其光響應曲線。

1.2 葉綠素熒光參數采集

采用德國Walz公司生產的MINI-PAM葉綠素熒光儀測定熒光參數與熒光響應曲線。選取油菜倒2葉片，首先采用弱光照射葉片測得初始熒光（Fo）；再用光強為5 000 μmol·m-2·s-1的飽和脈沖光照射獲得最大熒光（Fm）；隨后采用光化光進行連續照射，得到穩態熒光（F'）；再用飽和脈沖光進行照射，得到光適應下最大熒光（F'm）；光適應下初始熒光（F'o）由軟件自動導出。按以下公式計算最大光化學效率（Fv/Fm）、實際光化學效率（F'q/F'm）、激發能捕獲效率（F'v/F'm）、光化學淬滅（F'q/F'v）和非光化學淬滅（non-photochemical quenching，NPQ）等參數[6]。

Fv/Fm=（Fm-Fo）/Fm （1）

F'q/F'm=（F'm-F'）/F'm （2）

F'v/F'm=（F'm-F'o）/F'm （3）

F'q /F'v=（F'm-F'）/（F'm-F'o） （4）

利用MINI-PAM測定油菜熒光光響應曲線。測定過程中將已光適應的油菜倒2葉片暴露于30、60、120、250、500、750、1 000、1 250、1 500 μmol·m-2·s-1光照強度（photosynthetic photon flux density， PPFD）下，測定F'q/F'm、F'v/F'm、F'q/F'v與NPQ的光響應曲線。

1.3 數據分析

使用SPSS 16.0與Origin 7.5進行數據統計分析和圖表制作。

2 結果與分析

2.1 低溫脅迫下最大光化學效率變化

低溫處理1 d后，油菜葉片Fv/Fm較對照顯著降低；且隨著脅迫時間的延長，Fv/Fm呈現出逐漸降低的趨勢；低溫處理5～10 d后，Fv/Fm降至最低（圖1）。

2.2 低溫脅迫下熒光參數變化

對低溫脅迫下油菜葉片的F'q/F'm進行分析，結果（圖2）表明，F'q/F'm在低溫處理1 d后即呈現下降趨勢；在低溫脅迫5 d 后較對照顯著降低。F'v/F'm在低溫脅迫1 d后較對照顯著降低；且在整個試驗過程中均顯著低于對照。低溫處理1、3和10 d時，F'q/F'v較對照無顯著變化，表明光合電子傳遞在PSⅡ吸收光能中所占比例受低溫脅迫影響較小。與F'q/F'm與F'v/F'm等熒光參數不同，非光化學淬滅（NPQ）在整個試驗過程中較對照均未發生顯著變化。

2.3 低溫脅迫下F′q/F′m光響應曲線變化

油菜F'q/F'm隨著光照強度的增大呈現出逐步降低的趨勢，但不同脅迫時長的F'q/F'm光響應曲線存在一定差異。低溫脅迫1～3 d，脅迫組葉片F'q/F'm光響應曲線較對照變化較小；而脅迫5～10 d，F'q/F'm光響應曲線較對照大幅降低（圖3）。

2.4 低溫脅迫下F′v /F′m 與F′q/F′v 光響應曲線變化

分析不同光照強度下低溫處理后油菜葉片的F'v/F'm與F'q/F'v光響應曲線，結果（圖4和5）表明，隨著光照強度的增大，F'v/F'm 與F'q/F'v 對低溫脅迫的熒光響應存在差異。低溫脅迫1～3 d，F'v/F'm較對照降幅較小；而脅迫5～10 d，F'v/F'm較對照大幅降低。F'q/F'v光響應曲線在整個試驗過程中均較對照變幅較小。

2.5 低溫脅迫下NPQ 光響應曲線變化

隨著光照強度的增加，NPQ呈逐步升高趨勢；且NPQ光響應曲線的變化與低溫脅迫程度有關。低溫處理1～3 d，葉片的NPQ光響應曲線較對照變幅較小；而當光照強度大于750 μmol·m-2·s-1、低溫脅迫5～10 d，葉片的NPQ光響應曲線較對照呈大幅升高趨勢（圖6）。

3 討論

作為探測植物光合作用的有效探針，葉綠素熒光不僅能夠反映植物體內光能的吸收與傳遞等光合原初反應機制，還與碳同化等過程相關[10]。

因此，葉綠素熒光參數能夠反映逆境對植物光合生理進程的影響。最大光化學效率（Fv/Fm）是衡量作物熒光特性的重要參數，能夠反映PSⅡ光化學反應中心最大的光能轉化效率[11]。正常條件下，Fv/Fm比較穩定[1213]，約為0.80～0.85[7]；但低溫脅迫后，Fv/Fm較對照顯著降低，表明低溫脅迫對PSⅡ光化學反應中心造成了生理損傷。除Fv/Fm外，低溫脅迫還降低了PSⅡ光化學反應中心的激發能捕獲效率，進而導致PSⅡ反應中心產生的激發能減少。低溫脅迫1、3和10 d時，盡管參與光合電子傳遞的能量在PSⅡ吸收光能中所占比例（F'q/F'v）較對照均未發生顯著變化，但PSⅡ光化學反應中心的光能轉化效率受激發能捕獲效率降低的影響呈現出降低趨勢（圖2）。

非光化學淬滅（NPQ）是指PSⅡ反應中心吸收的光能中不參與光合電子傳遞，而以熱能形式耗散的部分[14]。本研究表明，低溫脅迫后油菜葉片NPQ未發生顯著變化。非光化學淬滅是作物自身的一種生理保護機制[15-17]，當PSⅡ反應中心活性降低，捕光色素吸收的光能無法用于光合電子傳遞時，往往通過升高非光化學淬滅的方式將過量激發能耗散掉[1819]，從而有效地避免能量過激發對光合器官造成的生理傷害[20]。在本研究中，雖然PSⅡ反應中心的光能轉化效率在低溫脅迫后顯著降低，但激發能捕獲效率亦隨之顯著降低。因此，無需升高非光化學淬滅即實現了PSⅡ反應中心的生理保護（圖2）。

光照強度對作物葉綠素熒光參數具有重要影響[2122]。本研究表明，油菜葉片F'q/F'm、F'v/F'm與F'q/F'v光響應曲線均隨著光照強度的增大而變化，可能是油菜通過調整PS Ⅱ反應中心活性來適應高光強，也有可能是高光強脅迫造成了光抑制現象[23]。同時，各熒光參數的光響應曲線對不同程度脅迫的生理響應存在差異。其中，F'q/F'm與F'v/F'm光響應曲線在脅迫初期（1和3 d）較對照降幅較小，而在脅迫5～10 d時較對照大幅降低。由此表明，低溫處理對油菜葉片F'q/F'm與F'v/F'm的影響與脅迫程度有關，輕度低溫脅迫對PSⅡ反應中心光能捕獲效率及光能轉化效率影響較小；重度低溫脅迫則會降低PSⅡ反應中心光能捕獲效率，進而降低其光能轉化效率，限制光能向化學能的轉化。低溫脅迫下，葉片F'q/F'v光響應曲線在整個試驗過程中較對照變幅較小，表明低溫脅迫下油菜葉片PSⅡ反應中心吸收的光能中用于光合電子傳遞的份額能夠維持穩定。

與F'q/F'm、F'v/F'm、F'q/F'v 等熒光參數光響應曲線不同，油菜葉片NPQ 光響應曲線均隨著光照強度的增大呈現出逐步升高趨勢。這可能是由于葉片在高光照強度環境下以增強非光化學淬滅的形式耗散了過剩激發量[24]。此外，當光照強度大于750 μmol·m-2·s-1時，中重度低溫脅迫使油菜葉片NPQ光響應曲線較對照大幅升高。這可能是由于中重度低溫脅迫下，PSⅡ反應中心在高光照強度下出現光抑制，捕光色素吸收的光能無法有效地轉化為化學能。為避免能量過激發對PSⅡ反應中心造成的生理損傷，油菜在長期進化過程中形成了有效的光合器官自我保護機制。在這一機制中，PSⅡ反應中心通過升高NPQ將過量激發能以熱量的形式耗散掉，從而避免能量過激發對光合器官的生理傷害[2526]。

綜上所述，低溫脅迫導致PSⅡ光化學反應中心遭受損傷，激發能捕獲效率降低；此時，雖然PSⅡ反應中心吸收的光能中用于光合電子傳遞的份額未發生顯著改變，但反應中心的光能轉化效率仍然呈現出降低趨勢。本試驗中，脅迫葉片的F'q/F'v 光響應曲線較對照變幅較小，F'v/F'm 與F'q/F'm光響應曲線在長期低溫脅迫下大幅降低，而NPQ光響應曲線的升高主要出現在長期低溫、高光強環境，由此表明，在長期低溫與高光強環境中，油菜會通過耗散過量激發能來實現對光合器官的自我保護。

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（責任編輯：張冬玲）