袋裝酸筍中優勢腐敗霉菌的分離與鑒定

吳錦蘭，李靜怡，白 云，鞏 僖，盧凱玲，崔 娜，熊建文

（1. 柳州工學院食品與化學工程學院，廣西 柳州 545616；2. 柳州市螺螄粉植物源性配料研究重點實驗室，廣西 柳州 545616；3. 柳州市特色食品風味與品質控制工程技術研究中心，廣西柳州 545616）

酸筍是一種特色的傳統性發酵食品，在我國南方地區被普遍應用于菜肴烹煮及作為各類食品的調味料。酸筍是以新鮮竹筍為原材料，通過食鹽進行腌制，經過漂水排氣后密封自然發酵制作而成[1-2]。發酵后的酸筍風味獨特，含有豐富膳食纖維成分與多種人體所必需的氨基酸，有輔助降血脂、提高機體抵抗力等作用[3-4]。酸筍作為柳州螺螄粉的靈魂，近年來受疫情影響，在“宅經濟”形勢下，袋裝螺螄粉銷售量迅速增長，對于袋裝酸筍的需求量也日益增加[5]。袋裝酸筍原料水分含量高、營養豐富，在發酵、生產操作、貯存等過程中易受到微生物污染而腐敗變質，發生脹袋、變色、軟化、腐臭變質等現象。部分腐敗微生物在一定適宜條件下，甚至會通過分泌產生相應的毒素，從而嚴重影響人類健康和生命安全[6]。在微生物污染中，霉菌污染是其中最主要、影響最大、危害也最大的污染[7-8]。目前，有關食品霉菌污染分析及控制的研究已經開展。岳曉禹等人[9]對貯藏玉米中的腐敗霉菌進行了分離，得到一株優勢腐敗霉菌M13，進一步鑒定為米曲霉（Aspergillus oryzae），為糧食的科學貯藏和食品安全控制提供參考。姚衛蓉等人[10]對焙烤食品的腐敗霉菌進行了研究，表明導致焙烤食品發霉的菌種主要是曲霉菌和青霉菌。張容鵠等人[11]對檳榔干果貯藏中優勢腐敗霉菌進行了分離和鑒定，得出2 種優勢霉菌，分別鑒定為泡盛曲霉（Aspergillus awamori） 和灰綠曲霉（Aspergillus glaucus）。謝欣等人[12]從已發霉變質的年糕中分離出優勢腐敗霉菌，初步鑒定為單端孢霉（Trichothecium）、青霉菌（Penicillium） 和曲霉菌（Aspergillus），并試用多種不同類型的防霉劑，結果表明脫氫醋酸鈉和肉桂精油結合使用，可達到抑菌、防腐和延長年糕保質期的目的。霉菌的種類和數量能基本反映食品的安全狀況，有效控制霉菌的生長、繁殖對保持食品的安全與營養非常重要。

目前，關于袋裝酸筍腐敗霉菌方面的研究甚少，為了預防和控制酸筍在腌制、生產和貯存中發生腐敗問題，從腐敗變質的袋裝酸筍中分離篩選得到優勢腐敗霉菌，并通過形態學觀察和分子生物學結合的方法對腐敗霉菌進行鑒定，分析腐敗霉菌的種屬特性，為袋裝酸筍生產工藝中篩選有效的抑菌劑及針對性的滅菌方法和優化貯藏條件等方面提供一定參考價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 原料

袋裝酸筍，市售，待其自然腐敗。

1.1.2 試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基PDA（附加抗菌素）、真菌基因組DNA 提取試劑盒等，廣東環凱微生物科技有限公司提供。

1.2 儀器與設備

SQ810C 型自動高壓蒸汽滅菌鍋，上海嵐薈生物科技有限公司產品；LRH-150 型生化培養箱，上海一恒科學儀器有限公司產品；Nikon Eclipse E200 型光學顯微鏡，上海衡浩儀器有限公司產品；L9800 型基因擴增儀，北京萊普特科學儀器有限公司產品；DYY-6D 型電泳儀，北京六一儀器廠產品；GenoSens 1880 型凝膠成像分析系統，上海勤翔科學儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 優勢腐敗霉菌的分離純化

取已腐敗袋裝酸筍置于裝有適量的無菌生理鹽水的錐形瓶中搖勻后進行10 倍梯度稀釋，取適當梯度的菌懸液200 μL 涂布于PDN 培養基中，于28 ℃條件下培養。待其長出霉菌后，挑取形態各異的菌株進一步分離純化，直至得到形態不同的單菌落并編號。

1.3.2 真菌菌株的形態學觀察

參考《真菌鑒定手冊》[13]進行形態學觀察。

1.3.3 菌種分子生物學鑒定

（1） 菌體的培養與收集。將分離活化的菌株接種到PDA 液體培養基中，在28 ℃下以轉速200 r/min 振蕩培養6 d，得到的菌絲培養液通過抽濾后收集菌絲。

（2） 真菌總DNA 的提取。稱取50～100 mg 真菌菌絲后倒入液氨研磨成粉末，然后按照真菌基因組DNA 提取試劑盒說明書提取總DNA。

（3） PCR 擴增。以提取的霉菌DNA 為模板，進行PCR 擴增待鑒定菌株的rDNA-ITS 區域，將最后得到的PCR 擴增產物通過1.2%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

PCR 引物表見表1，ITS 基因PCR 反應程序見表2，ITS 基因PCR 擴增程序見表3。

表1 PCR 引物表

表2 ITS 基因PCR 反應程序/μL

表3 ITS 基因PCR 擴增程序/次

（4） rDNA-ITS 堿基序列分析。將檢測合格的擴增產物送至華大基因生物有限公司進行測序，測序結果通過NCBI 網的BLAST 程序來搜索同源序列。

（5） 系統發育樹分析。挑選與靶目標列相似性較高的參考序列，采用MEGA7.0 的鄰接法構建系統發育樹。

（6） 菌種鑒定。根據菌株的形態學特征，結合系統發育學結果，對菌株進行鑒定[14]。

2 結果與分析

2.1 腐敗霉菌的分離純化

從腐敗袋裝酸筍中共分離純化出2 種主要的優勢腐敗霉菌，分別編號為F1、F2。在PDA 平板上28 ℃下培養7 d 后，菌株F1 菌落正面呈黃綠色，反面呈棕黑色，菌落中心有突起，質地緊密，棉絮狀，生長速度較慢，在PDA 平板上28 ℃下培養7 d 后直徑為15～20 mm（見圖1（a） 和（b））；菌株F2 菌落正面呈灰綠色四周呈白色，反面呈灰白色，菌落中心無突起，較平坦，質地疏松，絨毛狀，生長速度較快，在PDA 平板上28 ℃下培養7 d 后直徑為40～50 mm（見圖1（c） 和（d））。

在PDA 平板上28 ℃培養7 d 后菌落形態見表4，二種腐敗霉菌的菌落形態圖見圖1。

表4 在PDA 平板上28 ℃培養7 d 后菌落形態

圖1 二種腐敗霉菌的菌落形態圖

2.2 優勢腐敗霉菌的顯微結構

菌株在顯微鏡下的形態見圖2。

圖2 菌株在顯微鏡下的形態

將分離得到的2 種目標菌株進行顯微觀察。由圖2 可知，通過光學顯微鏡觀察發現，菌株F1 的菌絲有橫隔，分生孢子頭呈分枝根狀，分生孢子鏈生呈寬圓柱或廣橢圓形，壁較平滑；菌株F2 的菌絲有橫隔，分生孢子頭呈球狀，分生孢子近球形或橢圓形，壁稍光滑。

2.3 優勢腐敗霉菌的的分子學鑒定結果

優勢霉菌的PCR 產物電泳圖見圖3。

通過PCR 擴增，得到優勢腐敗霉菌的rDNA-ITS片段。由圖3 可知，霉菌F1、F2 的PCR 擴增產物均在500～750 bp 出現明顯目標條帶，ITS 序列分別為525 bp和555 bp，達到PCR 擴增預期結果。

圖3 優勢霉菌的PCR 產物電泳圖

將目標菌株的rDNA-ITS 片段為模板，通過Blast 檢索進行序列比對分析并構建系統發育樹，結果表明，菌株F1 與枝狀枝孢霉（Cladosporium cladosporioides） 親緣關系最近，達99.43%；菌株F2 與煙曲霉（Aspergillus fumigatus） 親緣關系最近，達99.31%。結合形態學觀察和分子生物學鑒定結果可知菌株F1 為枝狀枝孢霉（Cladosporium cladosporioides），菌株F2 為煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。

基于rDNA-ITS 基因序列菌株F1 的系統發育樹見圖4，基于rDNA-ITS 基因序列菌株F2 的系統發育樹見圖5。

圖4 基于rDNA-ITS 基因序列菌株F1 的系統發育樹

圖5 基于rDNA-ITS 基因序列菌株F2 的系統發育樹

3 結論

主要分離出了袋裝酸筍中的腐敗霉菌，通過傳統的真菌形態特征和顯微鏡觀察對分離出的菌株作了初步的鑒定，然后對純化菌株進行PCR 擴增rDNA-ITS 序列并測序和構建系統進發育樹，結合分子生物學法，最終確定了導致袋裝酸筍腐敗的菌株的種屬。袋裝酸筍中的優勢腐敗霉菌主要為枝狀枝孢霉（Cladosporium cladosporioides） 與煙曲霉（Aspergillus fumigatus）。其中，煙曲霉是常見食品腐敗霉菌，嗜高溫，在45 ℃或更高的溫度下生長茂盛，會引起食品的快速腐敗變質，使營養物質大量損失[14]。袋裝酸筍在工業化生產過程中，在不影響食品風味的條件下，可以從包裝條件及貯存溫度等方面抑制優勢腐敗霉菌的生長，從而達到延長產品保質期的目的，為今后防止袋裝酸筍在生產加工及銷售貯藏中腐敗變質，選擇適宜的殺菌保鮮方式提供一定參考依據。