嗜熱菌篩選及其腐熟菌劑制備和應(yīng)用

張智英，張 旭，林 童，解春艷，孫月雙，張旺林

（1.黃驊市自然資源和規(guī)劃局，河北黃驊 061100；2.滄州旺發(fā)生物技術(shù)研究所有限公司，河北滄州 061001；3.廊坊師范學(xué)院，河北廊坊 065000；4.滄州市農(nóng)林科學(xué)院，河北滄州 061001）

中國是食用菌生產(chǎn)大國，食用菌年產(chǎn)量超過4 000 萬t，占世界食用菌總產(chǎn)量的70%以上，是中國農(nóng)業(yè)的重要產(chǎn)業(yè)［1-3］。食用菌栽培基質(zhì)出菇率約為5∶1，每年產(chǎn)生食用菌基質(zhì)約2 億t。無論使用生料栽培還是熟料栽培，食用菌基質(zhì)都需高溫滅菌處理后再接種食用菌菌種，而該過程需要消耗大量的熱能，不僅增加了食用菌的生產(chǎn)成本，也增加了環(huán)境壓力。

堆肥是有機(jī)固體廢棄物無害化處理與資源化利用的重要手段，其實(shí)質(zhì)是有機(jī)物在微生物作用下分解代謝，促進(jìn)有機(jī)物向穩(wěn)定的腐殖質(zhì)轉(zhuǎn)化，同時(shí)殺滅廢棄物中的病原菌等有害生物［4，5］。堆肥不僅能夠解決有機(jī)固體廢棄物帶來的環(huán)境污染，而且可以將有機(jī)肥固體廢棄物轉(zhuǎn)化為有機(jī)肥，對(duì)保持和提高土壤肥力、促進(jìn)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義［6-8］。但常規(guī)微生物發(fā)酵堆肥腐熟后的食用菌基質(zhì)還不能免去加熱高溫滅菌的步驟，無法實(shí)現(xiàn)腐熟發(fā)酵后的基質(zhì)直接進(jìn)行食用菌接種。

嗜熱菌是生活在高溫環(huán)境中的微生物，廣泛存在于地?zé)釡厝⒒鹕娇凇⑷斯に疅岘h(huán)境和高溫好氧堆肥中，其細(xì)胞和酶蛋白獨(dú)特的耐熱性和與之相適應(yīng)的分子結(jié)構(gòu)，使其成為可在高溫環(huán)境中利用的重要微生物資源［9，10］。與常規(guī)微生物接種劑相比，好氧堆肥過程中添加嗜熱菌菌劑具有更高的微生物代謝活性和有機(jī)肥降解速率，能夠加快有機(jī)廢棄物堆肥進(jìn)程、更徹底地完成廢棄物的無害化，在固體有機(jī)廢棄物處理領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景和科學(xué)價(jià)值［11，12］。

本研究從溫泉樣品中分離、篩選出1 株耐高溫菌株，并對(duì)菌株進(jìn)行了生物學(xué)鑒定、嗜熱性能檢測(cè)、腐熟菌劑制備及堆肥性能檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)該嗜熱菌高溫適應(yīng)性強(qiáng)，適合的溫度范圍廣，能夠分泌纖維素酶和蛋白酶，能夠分解固體有機(jī)物料中的纖維素類物質(zhì)。堆肥腐熟后的食用菌基質(zhì)栽培試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該嗜熱菌腐熟菌劑能夠有效改善平菇栽培基質(zhì)的出菇情況，本研究可為食用菌栽培提供借鑒。

1 材料與方法

1.1 樣品及試劑

嗜熱菌篩選試驗(yàn)樣品采集于臺(tái)灣省文山溫泉。種子均購自中國科學(xué)研究院（入袋發(fā)芽率≥80%），試驗(yàn)前需進(jìn)行種子發(fā)芽率的測(cè)定，檢驗(yàn)其是否滿足80%以上標(biāo)準(zhǔn)。其他試驗(yàn)試劑均采購于中國醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

1.2 儀器設(shè)備

DHG 電熱鼓風(fēng)干燥箱（一恒科學(xué)儀器有限公司），YP6000N 型電子天平（上海越平科學(xué)儀器公司），SPX-250 型生化培養(yǎng)箱，HH-4 型數(shù)顯恒溫水浴鍋，SKD-1000 型全自動(dòng)凱氏定氮儀，TDZ4-WS 型電動(dòng)離心機(jī)，LDZX-50KBS 型立式壓力蒸汽滅菌鍋。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基配制 ZoBell2216E 固體培養(yǎng)基，蛋白胨5.00 g、酵母膏1.00 g、磷酸高鐵0.01 g、瓊脂18.00 g，陳海水定容至1 L，用5%煮沸氫氧化鈉調(diào)節(jié)至pH 7.8。121 ℃高溫高壓滅菌20 min。

LB 培養(yǎng)基，酵母提取物5.00 g、蛋白胨10.00 g、氯化鈉10.00 g，去離子水定容至1 L，121 ℃高溫高壓滅菌20 min。固體LB 培養(yǎng)基需添加18.00 g 瓊脂。

剛果紅羧甲基纖維素培養(yǎng)基，磷酸氫二鈉1.20 g、磷酸二氫鉀0.90 g、硫酸鎂0.50 g、氯化鉀0.50 g、酵母浸粉0.50 g、酸水解酪蛋白0.50 g、剛果紅0.20 g、羧甲基纖維素鈉5.00 g、瓊脂15.00 g，去離子水定容至1 L，121 ℃高溫高壓滅菌15 min。

1.3.2 菌種初步篩選 從臺(tái)灣省文山溫泉區(qū)采集溫泉樣品，溫泉溫度72 ℃。將樣品逐級(jí)稀釋，分別取稀釋后的樣品100 μL 涂布于ZoBell2216E 固體培養(yǎng)基上，60 ℃的鼓風(fēng)干燥箱中培養(yǎng)。挑取生長迅速的菌落在LB 平板上進(jìn)行5 次劃線分離純化獲得嗜熱菌純培養(yǎng)菌株。將菌株進(jìn)行5 次平板傳代后，每個(gè)菌株挑取5 個(gè)單菌落在60 ℃下培養(yǎng)，確定菌株高溫生長特性的遺傳穩(wěn)定性，獲得穩(wěn)定遺傳的嗜熱菌株。

1.3.3 纖維素酶活篩選 將篩選獲得的嗜熱菌株在LB 培養(yǎng)基上、60 ℃培養(yǎng)箱中活化培養(yǎng)24 h 后分別接種于剛果紅羧甲基纖維素培養(yǎng)基平板上，測(cè)量60 ℃恒溫培養(yǎng)3 d 后嗜熱菌的菌落直徑和水解圈直徑，篩選菌株。

1.3.4 分子生物學(xué)鑒定 按照細(xì)菌基因組DNA 提取試劑盒方法提取菌株基因組DNA，以原核生物通用引物27f 上游（5＇-AGAGTTTGATCCTGGCTC-3＇）和1492r 下游（5＇-GGTTACCTTGTTACGACTT-3＇）引物擴(kuò)增16S rRNA 基因。電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物的純度和大小，將擴(kuò)增長度正確的PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，并在NCBI 進(jìn)行BLAST對(duì)比。

1.3.5 腐熟菌劑制備 菌種活化，將-80 ℃保存的篩選菌株劃線接種于LB 平板上，50 ℃培養(yǎng)24 h。種子培養(yǎng)，用接種環(huán)刮去LB 平板上的菌株的菌苔并接種于裝有LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，50 ℃、200 r/min搖床培養(yǎng)24 h。二級(jí)種子發(fā)酵，將上述種子培養(yǎng)液按5%的接種量接種于裝有10 L LB 液體培養(yǎng)基的種子罐中，50 ℃、200 r/min 下發(fā)酵培養(yǎng)24 h。擴(kuò)大培養(yǎng)，得到的二級(jí)種子發(fā)酵液按3%的接種量接種于裝有LB 液體培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，50 ℃、200 r/min下發(fā)酵2 d。噴霧干燥，向擴(kuò)大培養(yǎng)的發(fā)酵液中加入輕質(zhì)碳酸鈣，再對(duì)發(fā)酵液進(jìn)行噴霧干燥，獲得含有嗜熱菌的腐熟菌劑。參照農(nóng)用微生物菌劑標(biāo)準(zhǔn)（GB 20287—2006）［13］的方法進(jìn)行嗜熱菌腐熟菌劑的檢測(cè)。

1.3.6 腐熟菌劑堆肥效果檢測(cè) 以含水量55%～65%、C/N 為20∶1，將雞糞與適量秸稈進(jìn)行混合，按0.5%接種量添加腐熟菌劑，進(jìn)行好氧堆肥，以接種不含嗜熱菌的腐熟菌劑的處理為陽性對(duì)照、不接種腐熟菌劑的處理為陰性對(duì)照。每天測(cè)量堆體溫度，發(fā)酵初期堆體每3 d 翻堆1 次，溫度超過60 ℃后每天翻堆，翻堆前測(cè)定堆溫，并于堆溫降至40 ℃后測(cè)定堆肥的C/N 比、有機(jī)質(zhì)、種子發(fā)芽指數(shù)等指標(biāo)判定堆肥的腐熟度。

1.3.7 C 含量檢測(cè) 采用重鉻酸鉀氧化-外加熱法［14］測(cè)定堆肥基質(zhì)中C 的含量。

1.3.8 N 含量檢測(cè) 采用凱氏定氮法［15］測(cè)定堆肥基質(zhì)中N 含量。

1.3.9 有機(jī)質(zhì)檢測(cè) 采用重鉻酸鉀容量法［16］對(duì)堆肥基質(zhì)中的有機(jī)質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.10 種子發(fā)芽率指數(shù) 將堆肥后的基質(zhì)與去離子水1∶10（m/V）混合均勻，振蕩30 min，室溫浸提1 h，3 500 r/min 離心10 min，取上清液備用。在含有濾紙片的培養(yǎng)皿中均勻地點(diǎn)播白菜種子，加入10 mL 上清液，25 ℃恒溫箱中連續(xù)培養(yǎng)72 h，以去離子水為對(duì)照，測(cè)定種子發(fā)芽率及發(fā)芽種子根長，計(jì)算種子發(fā)芽指數(shù)（GI）［17］：

1.3.11 平菇栽培 將平菇栽培基質(zhì)按平菇生長要求進(jìn)行配制［18］，并將物料含水量調(diào)整至60%，按0.5%接種量添加“1.3.5”制備的嗜熱菌腐熟菌劑，進(jìn)行堆垛發(fā)酵，堆垛底部寬度1.5 m，高度1.2 m，頂部呈龜背型。以不接種腐熟菌劑的平菇栽培基質(zhì)為對(duì)照，每天測(cè)量堆垛溫度。

將經(jīng)過嗜熱菌腐熟菌劑處理、不加菌劑處理（對(duì)照）及高溫蒸汽滅菌處理的3 種平菇栽培基質(zhì)進(jìn)行裝袋后接種平菇，接種方法和接種量相同，測(cè)定了不同處理下的基質(zhì)物料的出菇率和染菌率。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜熱菌菌種的篩選及鑒定

初步篩選獲得穩(wěn)定遺傳的嗜熱菌株11 株，對(duì)11株嗜熱菌進(jìn)行纖維素酶活篩選，發(fā)現(xiàn)有1 株嗜熱菌在剛果紅羧甲基纖維素平板上生長明顯，培養(yǎng)3 d 菌落直徑為0.42 cm、水解圈直徑1.04 cm，D/d 值為2.48，具有高溫分泌纖維素酶的能力。

將此嗜熱菌在不同培養(yǎng)溫度（28、37、45、55、65、75、85 ℃）的LB 培養(yǎng)基平板上培養(yǎng)48 h 后，發(fā)現(xiàn)45、55、65、75 ℃培養(yǎng)的LB 平板上有嗜熱菌菌落出現(xiàn)，且以55 ℃和65 ℃2 個(gè)溫度生長最為旺盛，表明該菌株的最適生長溫度為55～65 ℃，生長溫度為45～75 ℃，有著較廣的溫度適應(yīng)性。通過顯微鏡觀察該嗜熱菌形態(tài)，發(fā)現(xiàn)其為革蘭氏陽性，菌體長桿狀（圖1 a），中生或端生芽孢，且65 ℃培養(yǎng)24 h 可見直徑為1.5～2.5 mm 的菌落，菌落呈圓形、乳白色、邊緣規(guī)則、中央突起（圖1 b）。

圖1 嗜熱菌顯微鏡觀察結(jié)果（a）和平板培養(yǎng)（b）

將擴(kuò)增的PCR 產(chǎn)物送測(cè)并在NCBI 中進(jìn)行BLAST 比對(duì)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該菌株與Bacillus smithii菌株的16S rRNA 基因序列相似性高達(dá)99%。綜合菌落形態(tài)及部分生理特征和16S rRNA 序列，可以確定該菌株屬于Bacillus smithii，命名為B.smithiiBV-2，并于2018 年12 月15 日保存于中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，菌株保藏號(hào)為CGMCC No.18652。

2.2 嗜熱菌腐熟菌劑堆肥效果檢測(cè)

對(duì)制備的腐熟菌劑質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果表明，上述菌劑有效活菌數(shù)≥2×108cfu/g，符合農(nóng)用微生物菌劑標(biāo)準(zhǔn)（GB 20287—2006）［13］的規(guī)定，以雞糞堆肥檢測(cè)該嗜熱菌腐熟菌劑效果。

BV-2 接種劑對(duì)堆肥溫度的影響結(jié)果見表1。由表1 可知，堆肥接種BV-2 后，最高溫度可達(dá)81 ℃，達(dá)到高溫期的時(shí)間為發(fā)酵后3 d，超過55 ℃的高溫期為7 d、超過65 ℃的高溫期為5 d；接種常溫腐熟菌劑最高溫度為68 ℃，達(dá)到高溫期的時(shí)間為建堆后4 d，超過55 ℃的高溫期為10 d、超過65 ℃的高溫期為2 d；不接種腐熟菌劑的最高溫度為59 ℃，超過55 ℃的高溫期為4 d。說明BV-2 接種劑可明顯促進(jìn)堆肥前期發(fā)酵升溫，并能提高堆肥溫度、加快有機(jī)物料的腐熟轉(zhuǎn)化，使堆肥的進(jìn)程加快。

BV-2 接種劑對(duì)堆肥腐熟度的影響見表2。由表2 可知，堆肥接種BV-2 后，堆肥中有機(jī)質(zhì)含量高于陰性和陽性對(duì)照，C/N 低于陰性和陽性對(duì)照，腐熟完成后測(cè)定不同堆肥處理下的種子發(fā)芽指數(shù)，其中BV-2 處理的種子發(fā)芽指數(shù)為94.2%、普通常溫發(fā)酵菌劑的種子發(fā)芽指數(shù)為89.7%，而不接種處理種子發(fā)芽指數(shù)僅為64.5%。說明BV-2 接種劑的應(yīng)用能夠加快有機(jī)物料的腐熟，保存有機(jī)物料中的營養(yǎng)成分。

表2 BV-2 接種劑對(duì)堆肥腐熟度的影響

2.3 嗜熱菌腐熟菌劑應(yīng)用

將平菇栽培基質(zhì)按平菇生長要求進(jìn)行配制，以不接種腐熟菌劑的平菇栽培基質(zhì)為對(duì)照。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)接種腐熟菌劑24 h 后堆體溫度升至50 ℃，最高溫度達(dá)到85 ℃后開始降溫。堆肥接種嗜熱菌BV-2 腐熟菌劑后，最高溫度可達(dá)85 ℃，達(dá)到高溫期的時(shí)間為發(fā)酵后2 d，超過50 ℃的高溫期為4 d，超過65 ℃的高溫期為2 d。而不接種菌劑對(duì)照組的發(fā)酵最高溫度為64 ℃，超過50 ℃的高溫期為3 d，再次說明BV-2腐熟菌劑可明顯促進(jìn)平菇栽培基質(zhì)發(fā)酵升溫，并提高物料的溫度、加快物料的熟化和滅菌進(jìn)程。

通過測(cè)定不同處理后的基質(zhì)物料的出菇率和染菌率，并與已公開專利CN109609412A［19］中的嗜熱菌Bacillus smithiiThs1 制備的菌劑進(jìn)行效果比較，結(jié)果如表3 所示。嗜熱菌BV-2 腐熟菌劑處理的基質(zhì)染菌率為2.5%，低于高溫滅菌處理（4.2%）和對(duì)照（10.4%），說明嗜熱菌BV-2 腐熟菌劑處理能夠有效殺死或抑制平菇栽培基質(zhì)中的雜菌，降低平菇的染菌率。

表3 不同處理方法基質(zhì)的染菌率和出菇率

從出菇情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，其中嗜熱菌BV-2 腐熟菌劑處理基質(zhì)的出菇率為118.2%，高于高溫滅菌（108.6%）和空白對(duì)照（94.8%）。已公布的嗜熱菌Bacillus smithiiThs1 接種劑處理基質(zhì)的出菇率為103.3%，染菌率為6.7%，均比嗜熱菌BV-2 腐熟菌劑處理的基質(zhì)效果差，說明嗜熱菌BV-2 能夠有效改善平菇栽培基質(zhì)的出菇情況。

3 小結(jié)

本研究從臺(tái)灣省文山溫泉區(qū)采集溫泉樣品中篩選出1 株耐高溫且具有高纖維素酶活的嗜熱菌菌株，經(jīng)過鑒定此嗜熱菌屬于Bacillus velezensis，革蘭氏陽性，好氧、菌體長桿狀、中生或端生芽孢。以此嗜熱菌制備的腐熟菌堆肥最高溫度可達(dá)81 ℃，有機(jī)質(zhì)含量和種子發(fā)芽指數(shù)比常規(guī)腐熟菌劑均提高約1.05 倍。此外，以該腐熟菌劑栽培的平菇出菇率比高溫滅菌、不添加腐熟菌劑及已有的Bacillus smithiiThs1 腐熟菌劑栽培的平菇出菇率都高，且染菌率僅為2.5%。本研究篩選的嗜熱菌BV-2 可應(yīng)用于有機(jī)固體廢棄物的高溫堆肥處理，縮短堆肥發(fā)酵周期，提高堆肥處理效率，提高堆肥產(chǎn)品的質(zhì)量，且該嗜熱菌腐熟發(fā)酵處理得到的食用菌基質(zhì)可以完全代替高溫蒸汽滅菌處理得到的基質(zhì)，具有營養(yǎng)成分高、染菌率低、顯著增加食用菌出菌率的特性，改善傳統(tǒng)食用菌栽培基質(zhì)高溫高壓滅菌的弊端。