湖北省獼猴桃周年病害病原菌鑒定分析

鄧 蕾，潘 慧，李文藝，趙昆松，鐘彩虹，李 黎

（1.中國科學院植物種質創新與特色農業重點實驗室/中國科學院獼猴桃產業技術工程實驗室/中國科學院武漢植物園，武漢 430074；2.湖北省農業農村廳果茶辦公室，武漢 430000）

獼猴桃果實富含維生素、氨基酸及多種礦質元素，營養豐富，是中國山區農民精準脫貧的特色優勢樹種。湖北省地處長江中游，位于北緯29°05＇—33°20＇，東經108°30＇—116°10＇，氣候溫暖濕潤，自然條件優越，獼猴桃種質資源豐富，蘊藏量大，新西蘭早期選育的品種如海沃德等均起源自湖北省宜昌市夷陵區霧渡河鎮［1］。豐富且優異的獼猴桃資源優勢對發展湖北省山區經濟具有重要的現實意義。4 個已形成的獼猴桃生產區（秦巴山、幕阜山、武陵山及大別山生產區）的面積占全省栽培面積80%以上，主要分布在咸寧赤壁、宜昌夷陵、隨州曾都、廣水、恩施建始、咸豐、鶴峰、黃岡英山等地［2］。至2019 年，全省60 多個縣市的130 多家企業種植獼猴桃，種植總面積約1.33 萬hm2，結果面積約5 000 hm2，年產量約6 萬t，每公頃平均產值75 000 元，年農業產值超15億元，栽培品種主要有金魁、紅陽、金桃、金艷及建香等［3］。湖北省獼猴桃種植面積占全國獼猴桃栽培面積近10%，在中國主產區中排名第十位。

雖然湖北省在獼猴桃資源收集、評價和種質創新等方面的研究處于全國領先水平，但全省獼猴桃產業水平、品種結構、栽培管理及營銷策略等明顯落后于陜西省、四川省等地［4］。2018 年8 月湖北省農業農村廳展開了農業科技創新行動——“特色水果生態高效栽培與采后處理項目”，并出臺了《湖北省推進獼猴桃產業高質量發展實施方案》，省財政撥付專項資金支持該省各縣市發展獼猴桃，力爭在2022年將湖北省獼猴桃產業打造成繼柑橘、桃、梨之后的第四大特色水果產業。得益于該政策，湖北省一些貧困地區依靠獼猴桃種植帶動脫貧致富效果顯著，其中建始、宜昌、咸寧、浠水等市縣均已形成了一定的獼猴桃產業規模，并取得了較好的經濟效益。

然而，在獼猴桃產業迅猛發展的同時，多項研究報道湖北省獼猴桃病害問題日益突出，亟需盡快啟動全面病害調研及鑒定工作。楊清平等［5］研究發現湖北省獼猴桃主要病害有潰瘍病、花腐病、黑斑病、根腐病、黃化病及根結線蟲病等，并分別就各種病害的危害癥狀、發生規律及有機病害治理技術進行了介紹。鄭麗等［6］結合生產實踐經驗制定了湖北省獼猴桃綠色生產技術，其中包括了潰瘍病、褐腐病、褐斑病、藤腫病等病害，葉蟬、蝽象、金龜子、小綠葉蟬及介殼蟲等蟲害的防治方法。戢小梅等［7］調查發現，武漢市獼猴桃病蟲害主要為軟腐病、褐斑病及蝙蝠蛾。然而，以上研究均以病害癥狀觀察、總結經驗為主，尚未開展全面系統的病原菌鑒定。在此基礎上，2019—2020 年，中國科學院武漢植物園對湖北省赤壁、十堰、武漢、咸豐、宜昌及建始市6 個地區進行了周年感病樣本的采集及病菌類型鑒定，了解各地區的病害類型及危害程度，為后期開展病害預測及制定綜合防治方案奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 獼猴桃感病樣本采集

2019—2020 年4 月、6 月及11 月，分別對赤壁、十堰、武漢、咸豐、宜昌及建始市6 個地區共計49 個獼猴桃園區進行了春季、夏季及秋冬季病害調查及樣本采集工作（表1）。主要栽培品種均為紅陽、金艷、東紅、翠玉等，具體園區所在地區見表1。采樣期間，觀察到獼猴桃細菌性潰瘍病、真菌性軟腐病、灰斑病、褐斑病、黑斑病、根腐病及炭疽病等癥狀（圖1）。

圖1 湖北省部分獼猴桃栽培園區的主要病害感病癥狀

續表1

1.2 病原菌的分離和培養

1.2.1 細菌性病原菌的分離和培養 運用打孔器取3 片直徑為1 cm 的病健交界處葉片組織，70%乙醇消毒后置于含400 μL 10 mmol/L MgSO4和2 粒鋼珠的1.5 mL 離心管中進行勻漿及梯度稀釋，取100 μL濃度為10-4mmol/L 的菌懸液涂布在KB 固體培養基上，置于27～28 ℃培養2 d 后劃線分離。取陰性單菌落保存，每個樣本重復3 次。

1.2.2 真菌性病原菌的分離和培養 對于感病葉片，運用打孔器取3 片直徑1 cm 的病健交界處葉片組織，70%乙醇消毒。對于感病果實，切取病健交界處的果肉組織。隨后，分別將上述組織置于25 ℃的PDA 培養基上培養3 d，待菌落出現后挑取菌絲尖端于新PDA 平板上純化直至獲得純菌株，每個樣本重復3 次。

1.3 病原菌的分子生物學鑒定

1.3.1 細菌菌落PCR挑選新鮮菌落于20 μL 無菌水中98 ℃裂解10 min，吸取2 μL 上清液作為DNA模板。根據Rees-George 等［8］方法，運用Psa 特異引物PsaF1（5＇-TTTTGCTTTGCACACCCGATTTT-3＇）和PsaR2（5＇-CACGCACCCTTCAATCAGGATG-3＇）對各菌株進行分子鑒定。反應體系為10 μL，其中含Mg2+的10×PCR buffer 1 μL，10 mmol/L dNTP 0.2 μL，1.10 g/mL DMSO 0.2 μL，5 U/μLTaq酶0.1 μL，菌落模板2 μL，100 μmol/L PsaF1 和PsaR2引物各0.1 μL，無菌去離子水6.3 μL。PCR 擴增反應程序為94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個循環；72 ℃10 min。利用2%瓊脂糖凝膠檢測PCR 擴增產物，Psa 菌株可擴增出280 bp 的目的條帶。

1.3.2 真菌ITS 鑒定 在25 ℃條件下，將真菌純菌株在PDA 平板上培養5 d 后取5 塊直徑5 mm 的菌餅置于40 mL PDA 液體培養基中，靜置培養5～8 d 后收集菌絲。提取基因組，將DNA 置于-20 ℃下備用。采用核糖體基因組轉錄間隔區通用引物ITS4/ITS5（ITS5：5＇-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3＇ ；ITS4：5＇-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3＇）對DNA 進行PCR 擴增。反應體系為40 μL，其中含Mg2+的10×PCR buffer 4 μL，100 μmol/L 引物各0.2 μL，5U/μLTaq酶0.25 μL，10 mmol/L dNTP 0.8 μL，1.10 g/mL DMSO 0.8 μL，DNA模板2 μL，無菌去離子水31.75 μL。PCR 擴增反應程序為94 ℃5 min；94 ℃30 s，55 ℃30 s，72 ℃1 min，30 個循環；72 ℃10 min。經2%瓊脂糖凝膠電泳檢測，將目的條帶為600 bp 的PCR 產物送華大基因公司測序，并將測序結果在NCBI 中進行Blast 源性相似差異性分析，以確定該菌株的分類地位。

2 結果與分析

2.1 獼猴桃感病癥狀分析

在部分獼猴桃栽培園區觀察到疑似細菌性潰瘍病及真菌性軟腐病、灰斑病、褐斑病、黑斑病、炭疽病和根腐病的感病癥狀（圖1）［9，10］。潰瘍病感病癥狀：葉片上出現不規則褐色斑點，部分品種的感病葉片伴隨3～5 mm 明顯的黃色暈圈。褐斑病感病癥狀：葉片上出現3～15 mm 近圓形至不規則形的褐色病斑，病斑中央顏色比邊緣淺，呈靶點狀。黑斑病感病癥狀：葉片背面或果實表面著生黑色絨毛狀霉斑，后期感病部分果肉呈褐色壞死狀并形成錐形硬塊。炭疽病感病癥狀：葉緣略向葉背卷縮，病斑中間為灰白色，邊緣深褐色。軟腐病感病癥狀：發病部位出現大拇指壓痕斑，凹陷部病部中心果肉呈乳白色，周圍果肉呈黃綠色水漬狀。

2.2 細菌性病原菌的鑒定結果

春季細菌性病原菌的鑒定結果顯示，大部分獼猴桃栽培園葉片樣本均攜帶細菌性潰瘍病病原菌（圖2）。

圖2 部分獼猴桃感病園區樣本PsaF1/PsaR2 菌落PCR擴增結果

2.3 真菌性病原菌的測序結果及預測病害

在各獼猴桃栽培園區感病樣本上均分離到多種真菌（圖3），代表性的真菌菌株有鏈格孢菌、葡萄莖枯病菌、小孢擬盤多毛孢、球黑孢菌、葡萄座腔菌、菜豆間座殼菌等。夏季及秋冬季的具體菌株種類及各采樣點的預測病害見表1。

圖3 6 種代表性真菌菌株的菌落形態

3 小結與討論

協同創新是指以知識增值為核心，為了實現重大科技創新，政府、企業、知識生產機構（高校、研究機構）、中介機構和用戶共同開展的大跨度整合的創新組織模式。針對湖北省獼猴桃產業發展的重大需求，湖北省政府聯合中國科學院武漢植物園、湖北省農業科學院果樹茶業研究所及華中農業大學協同創新整合現有資源，將新的研究技術運用到生產實踐中，助力湖北省獼猴桃產業快速穩步發展。此次調查結果顯示，湖北省獼猴桃春季病害主要為細菌性潰瘍病，夏季及秋冬季主要病害有真菌性軟腐病、褐斑病、灰斑病、炭疽病、黑斑病及根腐病，與貴州六盤水、浙江泰順等地的病害規律基本一致［11，12］。

調研發現，湖北省產業存在抗性品種結構不合理，未形成區域化布局的問題。部分種植戶因部分紅心品種風味好、經濟價值高，在選擇品種時未綜合考慮種植地生態環境與品種適應性，因此，湖北省部分高海拔園區大規模種植潰瘍病易感品種，如紅陽，且將園區建在風口處或山坳中間，冬季極低溫較低，導致潰瘍病發生嚴重，對該病害的防治已成為湖北省獼猴桃產業中的關鍵問題。因此，建議將易感區域的老園區品種重新改接成高抗且耐粗放管理的品種，如翠玉、金魁等；新發展園區根據園區實際情況選擇合適的栽培品種，并應根據品種特性進行園區管理及病蟲害防治工作。此外，該病菌主要由帶菌苗木及花粉運輸傳播，部分園區對病蟲害防治意識不足，隨意從疫區引進接穗及花粉材料，導致潰瘍病發生嚴重。該病害的感病癥狀發生在枝干高發期、花期及開花后、葉片發病高峰及采果后、落葉前及冬季清園幾個時期，可根據“兩前兩后”三位一體精準防控技術進行周年防治［13，14］。

獼猴桃病害的類型和發生程度與園區管理存在緊密聯系。此次調研發現，部分園區栽植密度過大、濕度大、郁蔽、棚架低矮、冬季修剪及清園不仔細，導致葉部及果實的真菌病害嚴重；部分園區根頸或嫁接口栽植過深、起壟方式錯誤、土壤板結、排水不暢，導致根腐嚴重。其中，果實軟腐病是獼猴桃產業中較嚴重的真菌病害，在枝條上潛伏越冬，翌年早春花期時侵染花蕾，幼果形成時由花蕾轉移至幼果上，潛伏在表皮下，一般在貯藏期間才逐漸顯現病癥［15］。已確定的果實軟腐病菌種類包含葡萄座腔菌（B.dothidea）、擬盤多毛孢菌（Pestalotiopsissp.）、擬莖點霉菌（Diaporthesp.）、鏈格孢菌（A.alternata）［16，17］、球黑孢（N.sphaerica）［18］及小新殼梭孢菌（N.parvum）等［19］。湖北省多個采樣點均鑒定出上述致病菌，可見多個園區內潛伏著軟腐病菌，需對該病進行重點防治。此外，擬盤多毛孢菌會引起灰斑病［20］，鏈格孢菌及棒曲霉菌（Corynespora cassiicola）會引起褐斑病［21］，稻黑孢N.oryzae和D.glomerata會引起黑斑病和褐斑病［22，23］；鐮刀菌（F.lateritium）會引起根腐病［24］；膠孢炭疽菌C.gloeosporioides、C.boninense會導致炭疽病發生［25］，對于發現了上述真菌病菌的園區也需要進行針對性的防治。

總體而言，對湖北省獼猴桃病害進行了周年調查及主要病原菌類型鑒定，為各區域后期進行準確的病害預測預報及高效的綜合防治奠定了理論基礎。基于本研究結果，建議湖北省通過技術培訓增加種植戶對園區管理及病蟲害防控方面的知識，指導種植戶選用優質抗病品種和砧木，做好園區管理，控制產量，培育樹勢，注意土壤改良、加強排水設施及修剪、減少獼猴桃種植或套作密度、避免栽植過深，抓住采果后及冬春季治療關鍵期進行防治，農業防治與化學/生物防治結合，減少病害對湖北省獼猴桃產業的危害。