簡單重復序列標記熒光染料檢測和銀染顯影技術的比較

孫 祺，張 倩，柳 依，梁 芬，鄧譯婷，程麗莎，湯文浩，張 毅，4

（1.分子標記（武漢）生物育種有限公司，武漢 430070；2.長江大學生命科學學院，武漢 430100；3.湖北生物科技職業學院，武漢 430070；4.武漢工程大學光學信息與模式識別湖北省重點實驗室，武漢 430205）

簡單重復序列（Simple Sequence Repeat，SSR），也稱為微衛星序列，普遍存在于真核生物基因組和部分原核生物基因組中［1，2］。SSR 通常由1～6 個重復串聯的核苷酸組成，長度一般不超過100 bp［3］。作為常見的分子標記技術，SSR 標記技術與其他分子標記如限制性片段長度多態性（RFLP），隨機擴增多態性DNA（RAPD），區間-簡單重復序列（ISSR）相比，具有在基因組中廣泛分布、信息量較大、呈共顯性遺傳、序列短、容易擴增、多態性高和特異性位點穩定等優點，廣泛用于遺傳圖譜，品種鑒定，遺傳多樣性和生物進化，QTL 定位和分子標記輔助育種等研究領域［4-6］。

聚丙烯酰胺凝膠是生化試驗常用的支持介質，以聚丙烯酰胺凝膠為介質的聚丙烯酰胺凝膠電泳廣泛應用于蛋白質與核酸分離［7，8］，因其具有電滲作用小、分辨率高、不易擴散、靈敏度高、易于觀察等優點［9-11］，是遺傳圖譜構建、基因定位等遺傳育種研究的重要手段，特別是在SSR、ISSR、RFLP 等分子標記研究中具有不可替代的作用［12］。用染料和生物大分子結合形成有色復合物是聚丙烯酰胺凝膠電泳后檢測的常用方法，染色的方法有很多，如碘染，銀染，CuCl 染色，熒光染色等［13，14］。銀染法是重要的DNA 染色方法，該方法利用銀離子與核苷酸結合，并在堿性環境下使用甲醛使銀離子還原而使凝膠中的DNA 得以顯示為原理，具有高靈敏度和高分辨率得到廣泛應用［15］。傳統的銀染法操作流程含有固定、漂洗、銀染、漂洗、顯色和終止6 個主要步驟［16］，操作過程復雜且需提前配制反應溶液，使得其存在操作復雜、耗時費力等缺點，盡管已有一些研究對銀染法進行了改進，但這些改進在操作上仍存在不足［17，18］。銀離子會對人體及環境產生危害。相比于銀染法，熒光染料法則是在靈敏度準確的基礎上，操作更為簡便，數據整合更為方便的DNA 分子標記檢測技術［19］。基本原理是利用熒光染料能與核苷酸結合的特點，在特定紫外光激發下顯示出熒光條帶，使得核酸分子能夠被檢測出來［19］。

水稻是中國最早開展分子遺傳學和分子育種研究的糧食作物，且SSR 標記早已成熟應用于水稻分子標記輔助育種［20］。研究發現，在水稻基因組中，大約存在5 700～10 000 個SSR。SSR 標記已被廣泛應用于水稻遺傳背景鑒定、抗病性及香味性狀輔助育種、品種檢測等研究［21-24］。本研究運用SSR 熒光染料法和銀染法，選用水稻抗稻瘟病標記Pi2 對48個水稻材料進行檢測，并對這2 種方法的檢測效果作出了比較，并總結了各自的特點，以期建立成熟的SSR 標記熒光染料檢測技術。

1 材料與方法

1.1 材料

所選材料為水稻F2群體，由歸田園（武漢）現代農業科技有限責任公司提供。2022 年種植于歸田園試驗示范基地。

所選取的SSR 標記為抗稻瘟病SSR 標記Pi2，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物信息見表1。

表1 SSR 引物信息

1.2 方法

1.2.1 DNA 提取和PCR 擴增 選取生長10 d 的水稻幼嫩芽及下胚軸（300 mg）置于研缽中，提取DNA［25，26］。首先在裝有樣品的研缽中加入800 μL提取緩沖液（2% CTAB）研磨成勻漿；65 ℃水浴45 min 每隔15 min 取出并上下輕微搖動幾次；加入等體積的氯仿和異戊醇混合液（體積比為24∶1），搖勻；10 000 r/min 離心10 min，吸上清液并轉移到另一離心管中；加入2 倍體積預冷的無水乙醇（用以沉淀DNA），混勻后于-20 ℃靜置30 min；10 000 r/min離心30 s，棄上清液，75%乙醇清洗2～3 次，室溫下晾干后加入200 μL ddH2O（含2 μL 10 mg/mL 的RNase）溶解DNA。待DNA充分溶解后于-20 ℃保存。

PCR 反應采用10 μL 反應體系。模板DNA（50 ng/μL）1 μL，2×Taq Master Mix 5 μL，引物（10 μmol）0.5 μL，ddH2O 3.5 μL，反應試劑均為分子標記（武漢）生物育種有限公司自主研發；PCR 擴增程序為預變性94 ℃3 min，變性94 ℃30 s，退火56 ℃30 s，延伸72 ℃45 s，變性、退火、延伸3 個步驟重復35 個循環，再進行延伸72 ℃5 min，25 ℃保存10 min。反應完成后，加入8～10 μL Loading buffer，4 ℃放置備用。

1.2.2 聚丙酰胺凝膠電泳 將提前洗凈晾干的長玻璃和凹玻璃兩側各用1 個夾子夾住，組成膠槽。燒杯中先加入約100 mL PAGE 膠，再加入360 μL 10%AP 和36 μL TEMED 并迅速混勻，將混合液注入膠槽，灌膠過程盡量避免產生氣泡；再插入點樣梳子，深入約為3 mm；靜置約10～20 min。

在正極槽（底下）中加入600 mL 1×TBE 緩沖液，組裝上配好凝膠的玻璃板，負極槽上加入800 mL 0.5×TBE 緩沖液直至覆蓋了凝膠上方。緩慢拔出梳子，將凝膠上方多余的膠用槍沖洗干凈，并將氣泡清除，每孔加入0.8～1.5 μLDNA 樣品，采用55 W 恒定功率電泳30 min 左右，至第一條Loading buffer 指示帶（二甲苯青帶，約相當于260 bp 雙鏈DNA）跑至膠板的2/3 處（距底部1/3 處）時停止電泳。

1.2.3 SSR 標記顯影 熒光染料染色顯影，電泳結束后緩慢撬開玻璃板，取出凝膠，經過蒸餾水漂洗后，轉移至0.01%核酸染料（染料由分子標記（武漢）生物育種有限公司自主研發）中泡染10～20 min。泡然結束后用蒸餾水漂洗1 遍，隨后將聚丙酰胺凝膠至于凝膠成像儀（Bio-Rad）中進行拍照。

銀染顯影，將凝膠用蒸餾水漂洗2 遍，放入0.1% 的AgNO3染液中銀染10 min（1 000 mL 蒸餾水中加入1 g AgNO3），期間將銀染槽至于搖床上輕輕搖晃。銀染結束后用蒸餾水沖洗凝膠（5～10 s），隨后將凝膠浸在顯影液（1.5%NaOH，0.6%甲醛）中，顯影3～5 min，直至DNA 條帶出現。最后取出凝膠，用蒸餾水沖洗2 遍，室溫下自然干燥，拍照記錄。

2 結果與分析

2.1 2 種染色原理分析

銀染法是重要的DNA 染色法，其原理是利用銀離子可與核苷酸結合，形成穩定的復合物，在堿性環境下，用甲醛能使銀離子還原成銀褐色顆粒，從而使凝膠中的DNA 及RNA 都染成黑褐色得以顯帶。熒光染料染色法則是利用熒光染料能與核苷酸結合的特點，在特定紫外光激發下顯示出熒光條帶，使得核酸分子能夠被檢測出來。

2.2 2 種染色方法效果分析

利用水稻SSR 標記Pi2 檢測48 個樣本的基因型，結果見圖1。2 種染色方法均可以很好呈現標記帶型，但銀染顯影法的靈敏度相對更高。其中熒光染色方法膠圖背景干凈、清晰，標記DNA 帶型明顯，結果容易判讀（圖1a），而銀染法膠圖背景上有許多模糊條帶，對標記DNA帶型的讀取有一定干擾（圖1b）。

圖1 熒光染色成像（a）和銀染法成像（b）

2.3 2 種檢測方法的效益比較

對銀染法和熒光法的成本及其工作效率進行比較，結果見表2。由表2 可知，2 種方法的儀器基本相同，銀染法與熒光染料法完成1 個SSR 反應的試劑費用分別為1.30、0.93 元。因此，單純從藥品消耗估計經費預算，熒光染料法低于銀染法。由于微衛星熒光標記技術與凝膠成像系統組合，其檢測效率也顯著高于銀染法，同時由于熒光標記染色技術先進，不會出現銀染不足或銀染過度導致無法分辨基因型的現象，且熒光染料法的雜帶干擾少，便于后期讀帶，對試驗人員的要求低。在本研究規模和操作系統下，熒光法的工作效率是銀染法的2.2 倍，考慮到工資成本，熒光染料法較銀染法更為經濟。從環保性方面，由于銀染需要用到重金屬及揮發性甲醛，對試驗人員及環境影響較大。

表2 熒光染料法和銀染法檢測1 個樣品所需成本比較 （單位：元）

3 討論

SSR 標記現已廣泛應用于動植物研究的許多領域，由于其多態性好、數量多、易于檢測和低成本，被認為是用于分子遺傳及分子標記輔助選擇等研究最具競爭性的標記。已有超過35 000 個SSR 標記開發并映射到大豆所有的20 個連鎖群［27］。許多植物物種，如水稻，玉米，大麥等都開發了相關的SSR 標記［28-30］。在國家農業農村部頒布的新標準中，48 對均勻分布在水稻24 條染色體上的SSR 被發布出來，王志奎等［31］采用水稻這48 對SSR 引物研究這些標記與雜種優勢相關性，研究表明，主要經濟性狀與一些特定引物對應的特定條帶表現出較強雜種優勢，分子指紋帶型可以為雜種優勢的預測提供一定的指導意義。此外，葉凱等［32］利用農業農村部頒布的這48 個水稻SSR 和其實驗室開發的52 個水稻SSR 標記對江蘇水稻品種的真實性進行鑒定，研究表明，利用2 套標記整合后的93 個標記可區分所有有表型差異的品種，可以將這93 個標記用于江蘇水稻品種的真實性鑒定。這些標記為品種權的保護和鑒定提供重要的技術支持。

針對SSR 標記檢測采用的主要方法有瓊脂糖凝膠電泳檢測法、聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測法和毛細管電泳熒光檢測法等。隨著二代測序的發展，在植物中采用測序技術對SSR 標記進行開發也已取得了顯著的成果［33］。在這些SSR 標記檢測法中，聚丙烯酰胺凝膠電泳技術由于其檢測靈敏度和分辨率高的特點，特別適合SSR 這樣的小片段檢測，并且因其操作簡單、所耗時間短、檢測快捷有效在SSR 檢測中廣泛應用［34］。銀染法和熒光染料法是聚丙烯酰胺凝膠電泳后常用的顯影方法。銀染技術具有可與同位素相比擬的高靈敏度而廣泛使用［35］。然而銀染法操作繁瑣，對試驗操作者要求較高，并且銀染法所用的試劑對環境污染較大，對試驗人員健康也會產生影響。此外，銀染法的顯影時間不易掌控，若時間過短，DNA 條帶顯影不清晰，而過度顯影則會導致膠圖背景黑、噪音大，嚴重干擾結果讀取。盡管銀染法的改進方法有很多，但這些銀染法的具體操作差異較大，使得初次使用者難以作出最佳選擇。而SSR熒光染料檢測技術操作簡單，試劑安全，染色后背景干凈干擾小，結果易讀取，可以開發圖像識別軟件用機器讀帶，使得工作效率大為提高。

銀染法和熒光染色檢測方法對SSR 標記產物都能夠準確檢測，且均具有較高的靈敏度。從染色效果來看，熒光染料檢測方法與銀染法都能檢測出相應的條帶，但熒光染料檢測法，綜合成本低、效率高、所用試劑更為安全穩定、對環境友好、操作方便，不會對人類、環境造成毒害。因此，熒光染料檢測方法作為SSR 篩選的染色方法，在分子標記研究中更具有廣泛的推廣價值。

4 結論

本研究通過選取抗稻瘟病SSR 標記Pi2，利用48份水稻材料，對熒光染料檢測和銀染顯影技術2 種方法的優缺點進行探討。結果表明，2 種檢測方法均具有較高靈敏度，檢測出的條帶清晰可見。本研究研發的熒光染料檢測結果出現的條帶清晰度更高。從成本和環境保護角度來看，本研究提出的熒光染料檢測技術優于銀染顯影技術。