肺炎克雷伯菌乳房炎的致病機理及其耐藥性分析

李海源

莘縣畜牧獸醫事業發展中心，山東聊城 252400

0 引言

奶牛乳房炎是奶牛在養殖過程中乳腺部位受到外部物理、化學或病原微生物的入侵而導致炎癥反應的一種常見疾病。患病乳房內部會發生病理變化，主要表現為乳汁中體細胞數量增多、pH值大于7.0，NaCl的含量增高，電導率上升，細菌學鑒定為陽性等[1]。

奶牛乳房炎是一種危害牛群范圍廣的疾病，國外發病率可達25%～60%，國內的平均發病率可達33.4%[2]。我國每年由于乳房炎而淘汰的奶牛占總淘汰奶牛數的10%，經濟損失高達6 億元人民幣[3]。

奶牛乳房炎致病微生物主要分為傳染性病原微生物和環境型病原微生物，其中環境型病原微生物占主要地位[4]，主要包括大腸桿菌、乳房鏈球菌、停乳鏈球菌、沙雷氏菌、腸球菌和肺炎克雷伯菌等。它們廣泛存在于墊料等牛舍環境中，感染細菌后，可引起乳房部位發生急性紅腫，堅硬且有觸痛，乳汁呈絮狀或水樣，嚴重者產奶量顯著下降[5]。其中的肺炎克雷伯菌還能進一步感染奶牛尿道、呼吸道、甚至血液等，引發尿道炎、肺炎、菌血病[6]。

目前對肺炎克雷伯菌通常采用β-內酰胺類、喹諾酮類和氨基糖苷類等抗生素藥物治療，但由于這類藥物的濫用，導致肺炎克雷伯菌合成超廣譜β-內酰胺酶、碳青霉烯酶和氨基糖苷鈍化酶的基因表達上調，耐藥性進一步增強[7]。因此，對肺炎克雷伯菌的生物學特性、毒力基因和耐藥性有更深刻的認識是非常必要的。

1 生物學特性

肺炎克雷伯菌主要存在于機體口腔、皮膚和腸道以及自然界的水、土壤等外界環境中。該菌為革蘭氏陰性菌，屬于腸桿菌科，克雷伯菌屬，通常分為5 個種和3 個亞種，分別為肺炎種、產酸種、土生種、植生種、變形種，肺炎亞種、臭鼻亞種和鼻硬結亞種[8]。

肺炎克雷伯菌為兼性厭氧菌，能通過氧化和發酵等方式進行代謝，具有莢膜和菌毛等主要抗原成分，還能夠產生多種致病毒力因子。此菌對營養要求不高，在普通培養基中即可生長繁殖，菌落呈現白色粘液狀，體型偏大，用接菌環挑起后容易拉絲[9]。在37 ℃、pH值7.0～7.6條件下生長迅速，能產生大量莢膜多糖、脂多糖等細胞外毒性復合物，形成較厚莢膜[10]。

當機體免疫力正常時，肺炎克雷伯菌只是潛伏在機體內，而不會引發疾病；當機體免疫力下降時，其可突破機體免疫屏障，迅速繁殖并產生毒性，導致奶牛出現明顯炎癥反應，進而發生腦膜炎、腹膜炎、乳房炎、肺炎、膽囊炎、尿路感染和敗血癥等，發病率和致死率較高[11]。尤其在乳房炎方面，肺炎克雷伯菌會破壞乳腺分泌乳汁的能力，且發病緩慢，在早期不易發現，導致奶牛的泌乳能力長時間下降[12]，且治療后最高只能達到50%治愈率，比其他同種大腸菌群感染的治愈率更低[13]。

肺炎克雷伯菌基因組有5 000～6 000 個基因，其中約有2 000 個核心基因，剩下的均為副基因。在肺炎克雷伯菌毒力因子的合成中，核心基因和副基因共同進行編碼，如莢膜多糖、脂多糖、黏附因子和鐵載體等物質[14]。

2 流行病學調查

肺炎克雷伯菌感染范圍廣。有研究者對津巴布韋多個患病奶牛的致病菌數據進行分析，發現肺炎克雷伯菌占細菌總數的15.5%[13]。曹菲菲[15]等在2017—2018年，對浙江、江蘇、廣東、安徽、河北和內蒙古等地區11 個奶牛場的乳房炎奶牛的牛奶樣本進行采樣，從856 份樣品中分離出119 株肺炎克雷伯菌。Gao[16]等于2014—2016年對我國黑龍江、遼寧、北京、山東、天津、河南等地大型奶牛場的乳房炎奶牛的牛奶樣品進行分析，發現肺炎克雷伯屬細菌的分離率達13.0%。

肺炎克雷伯菌能長時間穩定存在，是影響奶牛乳房炎發病率的重要因素。Song[17]等于2018—2019年對山東、河北和黑龍江3 家規模化奶牛養殖場的乳房炎奶牛進行了長達2 年的持續跟蹤研究，采集6 301 份奶樣，分離出183 株肺炎克雷伯菌，2 年間對該菌的分離率較穩定，沒有顯著性差異。

3 肺炎克雷伯菌的毒力因子

3.1 莢膜多糖

莢膜多糖是由多個重復的寡聚糖衍生物組合形成，松散包裹細胞壁，幫助病菌對抗機體中補體介導的吞噬作用，還可抵抗宿主的非特異性免疫防御機制，也是肺炎克雷伯菌最重要的毒力因子之一。莢膜通常附著在病菌表面，入侵至機體后，莢膜可與菌毛協助作用，促進病菌定植、增殖和遷移[18]。不同個體肺炎克雷伯菌的莢膜不同，這是因為編碼莢膜多糖的基因中有一段可變區（CD1-VR2-CD2），通常根據此序列的變化來分型[19]。目前大部分肺炎克雷伯菌株的血清型屬于K1和K2，也有研究者對不同血清型的毒力進行檢測，發現K1、K2和K5這三種血清型的毒性較強，和某些人畜共患傳染病相關[20]。不僅如此，毒力高低還和莢膜多糖產生量相關，有部分菌株毒力增強就是因為莢膜多糖過量產生[21]。病菌感染初期，莢膜多糖可幫助病菌抵抗免疫細胞吞噬，抵御抗菌肽作用，還可抑制早期免疫應答和樹突狀細胞的成熟[22]。

3.2 脂多糖

脂多糖是革蘭氏陰性菌細胞外膜的重要組成部分，由糖、蛋白質和磷脂復合物組成，也被公認為是細菌引起敗血性休克的主要原因。其中由于O抗原結構不同分為不同血清型，最主要的為O1、O2和O3三種血清型[23]。脂多糖的變化也會影響細菌對抗菌肽的抵抗作用，且能誘導機體發生炎癥反應。

3.3 黏附因子

病菌侵染宿主細胞時，黏附是細菌定植的關鍵，病菌靠自身的黏附素與宿主表面受體特異性結合，為后續侵襲和繁殖做好基礎[24]。肺炎克雷伯菌則通過菌毛完成，主要包括Ⅰ型菌毛、Ⅲ型菌毛和非纖毛型的黏附蛋白。

I型菌毛是由一組Fim（A、B、C、D、E、F、G、H、I）基因群表達，其中Fim H可編碼I型菌毛尖端的黏附蛋白的表達[25]。I型菌毛可穿透莢膜向外延伸，調節機體對宿主細胞D-甘露糖的敏感性黏附，且實驗證明I型菌毛是引起尿路感染的重要因素。

Ⅲ型菌毛具有甘露糖抗血凝特性，可凝集經鞣酸處理過的紅細胞。由Mrk（A、B、C、E、F）基因群編碼，其黏附蛋白位于菌毛尖端，由Mrk基因進行編碼[26]。Ⅲ型菌毛有利于細菌黏附在機體的呼吸道、消化道和泌尿生殖道等黏膜上皮細胞，且促使宿主表面生成生物被膜。MrkD基因對Ⅲ型菌毛十分重要，缺失 MrkD 后會導致細菌無法結合基質外的成分，生物被膜形成也受到限制[27]。

3.4 鐵載體

鐵載體是細菌分泌的一種小分子、高親和力的鐵螯合分子，細菌可通過該物質來攝取生長發育所需的鐵元素。目前發現在肺炎克雷伯菌中具有4 種鐵載體，分別是產氣菌素、沙門菌螯鐵蛋白、腸桿菌素和耶爾森桿菌素，這些鐵載體能使肺炎克雷伯菌生長在低鐵濃度環境中。鐵載體的不同與宿主的感染部位及嚴重程度有關，但研究發現，臨床上大部分的分離株都具有腸桿菌素，且編碼腸桿菌生產的基因與生物被膜的形成息息相關，所以腸桿菌素被認為是病菌主要的鐵吸收系統[28]。

3.5 外排泵

外排泵能將病菌細胞中的藥物排出，導致藥物作用下降，外排泵也通常與肺炎克雷伯菌的抗生素耐藥性相關。肺炎克雷伯菌的外排泵較多，主要有RND家族外排泵AcrAB-TolC、OqxAB，MFS家族外排泵KmrA、KdeA、KpnGH，SMR家族外排泵KpnEF，MATE型外排泵KetM[29]。

4 耐藥性分析

過去幾十年中，肺炎克雷伯菌耐藥性急劇增加，除了和藥物濫用有關外，也和肺炎克雷伯菌本身特性相關。獸醫臨床上，在大量抗生素刺激下，肺炎克雷伯菌能產生抗生素水解酶，導致耐藥菌株數量不斷增加，使該菌防治變得困難。肺炎克雷伯菌對不同抗生素的敏感性具有較大差異，如對氨芐西林具有較好的先天耐藥性，這是因為其染色體中存在SHV-1青霉素酶，對其他藥物的耐藥性則是和染色體位點的突變有關[30]。其中，含有廣譜β-內酰胺酶的肺炎克雷伯菌對第3代頭孢具有較強耐藥性，但對頭孢吡肟這類第4代頭孢耐藥性較差，含有此類酶的病菌對幾乎所有的β-內酰胺類抗生素均具有良好耐藥性[31]。對碳青霉烯類抗生素的耐藥性和肺炎克雷伯菌的ST11、ST14、ST101、ST147和ST258等序列密切相關，這些編碼碳青霉烯酶的基因一部分存在染色體上（IMI-1、NMC-A、SME、SHV-38和SFC-1等），一部分存在質粒上（KPC、GES和IMI-2等）[32]。

國外的研究發現，肺炎克雷伯菌的耐藥性在逐漸增強。Jong[33]等對歐洲國家奶牛乳房炎樣品中的肺炎克雷伯菌耐藥性進行分析，發現其對四環素的耐藥性為19.5%，對頭孢噻呋不具耐藥性。曹菲菲[15]等對從乳房炎中分離出的119 株肺炎克雷伯菌的耐藥性分析發現，其對胺比西林的耐藥性達94.96%。Sanchez[34]等對搜集12 年間的3 132 354 株肺炎克雷伯菌的耐藥性進行探索研究，發現對碳青霉烯類藥物具有耐藥性的肺炎克雷伯菌對四環素和丁胺卡那霉素的交叉耐藥性較低，但對其他抗菌藥物的耐藥性都增加。Otter[35]等對倫敦40 例由肺炎克雷伯菌引起的傳染病分析發現，肺炎克雷伯菌在10 個月時間內發生3 次變異，變異后對秋水仙素的耐藥率達66%。Sikarwar[36]從印度多個地區收集20 株肺炎克雷伯菌，發現其中54%的菌株具有多種耐藥性，60%以上的菌株對氯霉素和四環素具有較好耐藥性，28%～76%的菌株對頭孢噻肟具有較好耐藥性。

有研究者對我國肺炎克雷伯菌的耐藥性分析歸納，發現從2005—2017年，肺炎克雷伯菌對亞胺培南、美羅培南的耐藥性由3.0%、2.9%上升到20.9%、24.9%，增長迅速[37]。高興[38]等對212 株肺炎克雷伯菌的耐藥性進行對比，發現其對頭孢吡肟的耐藥性為5.7%，對環丙沙星的耐藥性為4.7%，對頭孢他啶的耐藥性為4.2%，對美羅培南的耐藥性為2.8%，對厄他培南的耐藥性為0.5%，對亞胺培南和替加環素沒有耐藥性。賈麗[39]等對32 株肺炎克雷伯菌的耐藥性分析發現，對恩諾沙星的敏感率最高，可達96.875%，部分病菌具有多重耐藥性，特別是對氨芐西林、多西環素、復方新諾明、頭孢唑啉的耐藥性較高。

5 總結

用抗生素治療肺炎克雷伯菌引起的乳房炎是奶牛場最常用的選擇，但由于抗生素濫用，導致肺炎克雷伯菌耐藥性越來越嚴重，成為治療和預防乳房炎的重大難題。肺炎克雷伯菌多種毒力因子和能產生耐藥性的特殊機理對防治該菌構建較大困難。因此，要降低肺炎克雷伯菌的危害，應做好其毒力作用機制和耐藥性特性的研究，更深入探索肺炎克雷伯菌的耐藥機制，更準確指導臨床用藥，從而更好防防治肺炎克雷伯菌引起的乳房炎，降低其危害。