裸燕麥硬度相關基因 AnVin-2的等位變異與表達分析

張文靜,王 軻,2,安江紅,2,秦海英,劉慧艷,2,楊 燕,2,韓 冰,2

(1.內蒙古農業大學生命科學學院,內蒙古呼和浩特 010018; 2.麥類種質創新利用自治區高等學校重點實驗室,內蒙古呼和浩特 010018)

燕麥是禾本科(Gramineae)燕麥屬(AvenaL.)一年生草本植物[1-2],可分為帶稃型的皮燕麥和不帶稃型的裸燕麥兩種類型,其栽培種是世界性糧飼兼用作物[3-4]。在國外,主要栽培種為普通栽培燕麥(AvenasativaL.);在國內,主要栽培種為大粒裸燕麥(AvenanudaL.),主要分布在我國華北、西北及西南地區[5-6]。燕麥中富含多種氨基酸和膳食纖維,其中β-葡聚糖作為膳食纖維的一種,具有良好的降血脂效應[7],可降低多種潛在疾病發生的風險[8]。

籽粒硬度是指破壞籽粒所需力的大小,反映籽粒的質地,是麥類作物重要的品質性狀之一[9]。籽粒硬度值與胚乳中淀粉和蛋白質之間的相互作用有關,軟質麥胚乳淀粉粒間較分散,基質蛋白質與其呈分離的狀態;而硬質麥胚乳蛋白質基質與淀粉粒之間結合較為緊密,淀粉粒被蛋白質緊緊包裹[10]。燕麥籽粒硬度對于籽粒加工有很大影響,直接決定磨粉出粉率、燕麥片爽滑度、燕麥米彈性,因此了解燕麥的籽粒硬度,有利于燕麥的開發利用。

2015年,Gazza等[11]發現了影響燕麥籽粒硬度的Vromindoline(Vin)蛋白家族,該家族包含Vin-1、Vin-2和Vin-3三個成員,分別由Vin-1、Vin-2和Vin-3基因編碼;向不含籽粒硬度同源基因的硬粒小麥Svevo轉化中Vin-D2a和Vin-A3a基因后,籽粒硬度降低50%。這說明Vin蛋白是一種燕麥屬特異的淀粉結合蛋白,具有脂質結合特性,可通過影響淀粉顆粒表面和周圍基質蛋白質之間的粘附作用,影響燕麥籽粒的硬度[12-13]。

本研究選用裸燕麥核心種質材料街棚莜麥對燕麥Vin-2(AnVin-2)基因進行克隆和基因標記開發,根據前期試驗測定的裸燕麥籽粒硬度值(未發表),選取10個不同籽粒硬度的裸燕麥材料(5 份軟質,5 份硬質)驗證分子標記,并進行Vin-2基因的等位變異及表達模式分析,以期為闡明Vin-2基因在裸燕麥籽粒硬度中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 供試材料

試驗材料共11份(表1),由國家種質資源庫提供。種植于內蒙古烏蘭察布市燕麥分子育種基地(113°087 ′E,41°12 ′N),每行種植1.5 m,行距40 cm,田間管理按照大田標準進行。成熟籽粒收獲后晾干,保持籽粒水份一致,儲存于倉庫。其中,街棚莜麥用于開發燕麥AnVin-2基因A、C 和 D 染色體組的標記以及AnVin-2C1和AnVin-2C4基因的標記;同時,街棚莜麥用于分析AnVin-2基因在籽粒不同發育時期的表達豐度,73014-336、8399/3/4、冀麥二號和7929/1/6用于分析AnVin-2基因在不同硬度品種成熟籽粒中的表達豐度。燕麥、73014-336、小莜麥、同系四五六號、8399/3/4、蒙燕7805、蒙燕8202、冀雜二號、7929/1/6和晉8713-1這10個品種用于分析AnVin-2C1和AnVin-2C4基因的等位變異。

1.2 樣品采集

以街棚莜麥為材料,根據單個小花開花日期以及籽粒發育形態確定開花授粉時間,采集授粉后1、7、14、21、28、35 d和成熟期干籽粒,用滅菌鑷子隨機摘取籽粒,立即放入液氮中,隨后放入-80 ℃超低溫冰箱中保存。每樣品每次取10～20粒種子,用于 RNA 的提取。

1.3 引物設計及篩選

從NCBI中分別獲取普通栽培燕麥AnVin-2.1、AnVin-2.2和AnVin-2.3(基因ID分別為JQ518369.1、JQ518370.1和JQ518371.1)基因的DNA序列,設計通用引物 AnVin-2-F/R(表2),通過PCR擴增得到目的片段。根據該擴增片段的測序結果,使用ARMS-PCR方法[12-13],利用Primer 5.0設計特異性引物,即在3′端引物錯配堿基以增加引物的特異性。分別設計AnVin-2的A、C、D染色體組標記引物(AnVin-2A-F/R、AnVin-2C-F/R和 AnVin-2D-F/R)以及AnVin-2C1和AnVin-2C4基因的分子標記特異性引物(AnVin-2C1-F/R和AnVin-2C4-F/R)(表2)。試驗所用引物均由北京六合華大有限公司合成。

表2 本研究所用的引物信息

1.4 DNA和總RNA的提取以及cDNA的合成

用DNAsecure Plant Kit試劑盒(天根,北京)提取基因組DNA,用Transzol Up Plus試劑盒(全式金,北京)提取總RNA,用Thermo NanoDropTMOne/OneC超微量紫外分光光度計測定RNA的濃度,用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA的完整性,用EasyScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis Super Mix(全式金,北京)將RNA進一步反轉錄合成為cDNA。

1.5 AnVin-2基因的克隆

用AnVin-2-F/R引物在Biometra PCR儀上進行PCR擴增,PCR擴增體系為20 μL,包括基因組DNA 1 μL,上、下游引物各0.3 μL,LA Taq(TaKaRa,大連) 0.5 μL,dNTP 1.5 μL,5×Buffer 4 μL,ddH2O 12.4 μL。PCR反應程序:94 ℃預變性5 min;94 ℃變性30 s,退火30 s,72 ℃延伸20 s,35個循環;72 ℃延伸7 min。用Easy Pure Quick Gel Extraction Kit說明書(全式金,北京)對DNA片段回收純化后,連接至PMD-19T載體,并轉化至DH5α大腸桿菌感受態細胞中,篩選陽性克隆并測序。

1.6 AnVin-2基因序列比對及系統發育分析

將測序得到的AnVin-2基因序列通過Primer 5.0推導獲得氨基酸序列。從NCBI下載普通栽培燕麥(Avenasativa)、小麥(Triticumaestivum)、山羊草(Aegilopstauschii)、黑麥(Hordeumvulgare)和玉米(Zeamays)5個物種的Vin-2蛋白氨基酸序列,用Blastp進行同源性比較,用MEGA 6.0軟件進行系統進化樹的構建,bootstrap設置為1 000。

1.7 不同硬度裸燕麥品種 AnVin-2C4基因不同等位變異的鑒定

以10份不同籽粒硬度裸燕麥品種的基因組DNA為模板,用AnVin-2C1-F/R和 AnVin-2C4-F/R引物在Biometra PCR儀上進行PCR擴增,將擴增產物送北京六合華大有限公司進行測序,PCR反應體系及反應程序同1.5。由于在燕麥品種73014-336、8399/3/4、冀雜二號和7929/1/6中未能克隆到AnVin-2C1基因,只有AnVin-2C4基因在10份材料中均擴增得到目的片段,因此用DNAMAN軟件僅分析AnVin-2C4基因的等位變異。

1.8 AnVin-2基因的表達模式分析

利用半定量反轉錄-聚合酶鏈式反應(Semi-quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,SqRT-PCR),以Ta2776為內參基因[18],PCR反應體系及反應程序同1.5。檢測AnVin-2A、AnVin-2C和AnVin-2D基因在街棚莜麥籽粒中不同發育時期(開花后1、7、14、21、28、35 d和成熟期)的表達豐度,以及AnVin-2基因在73014-336、8399-3-4、冀雜二號和7929-1-6四份裸燕麥品種成熟籽粒中的表達豐度。用Quantity one圖像分析軟件分析各基因對應電泳條帶的灰度值,計算AnVin-2基因與內參基因Ta2776之間的比值,為AnVin-2基因的相對表達量。采用Excel和SPSS 25.0對數據進行整理和方差分析。

2 結果與分析

2.1 AnVin-2基因的克隆與序列分析結果

以街棚莜麥的基因組DNA為模板,利用通用引物AnVin-2-F/R進行PCR擴增,獲得大小約為500 bp的條帶(圖1)。對100個陽性克隆測序的結果進行整理,共獲得14個AnVin-2基因(圖2)。將這14個AnVin-2基因序列在普通栽培燕麥基因組數據庫(https://wheat.pw.usda.gov/jb/?data=/ggds/oat-ot3098-pepsico)中進行比對定位,將其分別定位到4A、7C和4D染色體上。結合定位結果將這些基因分別命名為AnVin-2A、AnVin-2C1、AnVin-2C2、AnVin-2C3、AnVin-2C4、AnVin-2C5、AnVin-2C6、AnVin-2C7、AnVin-2C8、AnVin-2D1、AnVin-2D2、AnVin-2D3、AnVin-2D4和AnVin-2D5。進一步分析發現,這14個基因的序列長度為523～526 bp,序列同源性為 98.06%,均包含完整的開放閱讀框(444 bp),無內含子,可編碼147個氨基酸。以上結果表明,AnVin-2作為多拷貝基因存在于裸燕麥中。氨基酸序列分析表明,這14個AnVin-2基因編碼的蛋白氨基酸序列均存在10個保守的C骨架和4個色氨酸殘基構成的TRD結構域。應用NCBI Conserved Domain Search對蛋白結構域分析顯示,AnVin-2蛋白屬于AAI_LTSS家族SS亞家族。

M:DL2000; 1～3: AnVin-2.

2.2 AnVin-2基因的同源分析

為了探索裸燕麥AnVin-2基因家族的進化關系,對其編碼的蛋白及其他5個物種的同源蛋白進行進化分析。結果(圖3)顯示,這些蛋白聚類于三個不同的分支。其中,14個AnVin-2蛋白與小麥、山羊草和黑麥的SS蛋白亞家族聚類于一個分支;小麥、山羊草、黑麥和燕麥的AAI蛋白亞家族聚類于第二分支;小麥、山羊草、黑麥和玉米的LTP蛋白聚類于第三分支。

As:燕麥;Hv:黑麥;Ae:山羊草;Ta:小麥;Zm:玉米。

2.3 AnVin-2基因的A、C、D染色體組標記開發

經AnVin-2基因序列比對分析發現,AnVin-2A與AnVin-2D基因的序列高度相似,相似性高達98.04%,基因序列間均為單堿基的差異,不存在大片段的插入與缺失。從40對基因標記引物中篩選出帶型質量高、擴增結果穩定的引物,最終篩選出3對引物( AnVin-2A-F/R、AnVin-2C-F/R和AnVin-2D-F/R),分別用于特異性擴增AnVin-2A、AnVin-2C和AnVin-2D。其中,AnVin-2A與AnVin-2C、AnVin-2D在165 bp處存在特異性位點C,據此開發出可以特異區分AnVin-2A基因的標記AnVin-2A;AnVin-2C與AnVin-2A、AnVin-2D在274和279 bp兩處存在特異性位點C,據此開發出可以特異區分AnVin-2C基因的標記AnVin-2C;AnVin-2D與AnVin-2A在165 bp處存在特異性位點T,AnVin-2D與AnVin-2C在324和333 bp處分別存在特異性位點C和G,根據以上三個特異性位點開發出可以特異區分AnVin-2D基因的標記 AnVin-2D(表2和圖2)。經過PCR筆測序驗證,發現AnVin-2A、 AnVin-2C和AnVin-2D這3個標記可分別特異識別AnVin-2A、AnVin-2C和AnVin-2D基因(圖4)。

M:DL2000; 1: AnVin-2A; 2: AnVin-2C; 3: AnVin-2D.

2.4 AnVin-2C1和 AnVin-2C4基因的分子標記開發

由于在街棚莜麥中擴增得到的14個AnVin-2基因中,只有AnVin-2A、AnVin-2C1、AnVin-2C4和AnVin-2C5存在特異性位點(圖2);又由于AnVin-2A和AnVin-2C5在裸燕麥各個生育時期并未擴增到,因此僅開發AnVin-2C1和AnVin-2C4基因的分子標記。

其中,AnVin-2C1與其他13個基因在367 bp處存在特異性位點T,據此開發出AnVin-2C1標記;AnVin-2C4與其他13個基因在274 bp處存在特異性位點C,據此開發出AnVin-2C4標記(表2和圖2)。經過PCR和測序驗證,發現AnVin-2C1和AnVin-2C4標記可分別特異識別AnVin-2C1和AnVin-2C4基因。

2.5 不同硬度裸燕麥 AnVin-2C4不同等位變異的鑒定

以AnVin-2C1-F/R和AnVin-2C4-F/R為引物,以10份不同籽粒硬度裸燕麥品種(燕麥、73014-336、小莜麥、同系四五六號、8399/3/4、蒙燕7805、蒙燕8202、冀雜二號、7929/1/6和晉8713-1)基因組DNA為模板,克隆AnVin-2C1和AnVin-2C4基因。由于在燕麥品種73014-336、8399-3-4、冀雜二號和7929-1-6中未能克隆到AnVin-2C1基因,只有AnVin-2C4基因在10份材料中均擴增得到目的片段,因此后續僅分析AnVin-2C4基因。

測序結果顯示,AnVin-2C4基因在10份材料中存在5種等位變異,分別命名為AnVin-2C4-1、AnVin-2C4-2、AnVin-2C4-3、AnVin-2C4-4和AnVin-2C4-5(圖5)。與AnVin-2C4-1等位基因相比,AnVin-2C4-2在74 bp處發生C-A的無義突變;AnVin-2C4-3在179 bp和215 bp處分別發生T-C和G-A的無義突變,AnVin-2C4-5在266 bp和271 bp處分別發生C-G和C-G的有義突變,導致78位亮氨酸突變為纈氨酸;AnVin-2C4-4在100、119、135、149 和215 bp處分別發生T -C、C-T、G-T、T-C、G-A的突變,導致22位纈氨酸突變為丙氨酸以及34位丙氨酸突變為絲氨酸。

圖5 AnVin-2C4的5種等位變異序列比較

2.6 AnVin-2基因的表達模式分析

以街棚莜麥為材料,以Ta2776基因為內參,利用SqRT-PCR檢測AnVin-2A、AnVin-2C和AnVin-2D基因在燕麥籽粒不同發育時期(開花后1、7、14、21、28、35 d和成熟期)的表達豐度(圖6),利用Quantity one圖像分析軟件分析各基因對應電泳譜帶的灰度值,計算Vin-2基因的相對表達量(圖7)。結果顯示,AnVin-2C和AnVin-2D基因的表達量在7個發育時期的變化趨勢基本一致,均在開花后21 d表達量達到峰值,在開花后1、7、35 d和成熟期表達量較低。AnVin-2A基因在裸燕麥籽粒各個發育階段均沒有檢測到。

以4種不同籽粒硬度的裸燕麥品種(73014-336、8399/3/4、冀雜二號和7929/1/6)為材料,利用標記引物AnVin-2A-F/R、 AnVin-2C-F/R和AnVin-2D-F/R(SqRT-PCR法)檢測AnVin-2基因在成熟籽粒中的表達豐度(SqRT-PCR法),結果(圖6和圖7)顯示,AnVin-2C基因在在冀雜二號成熟籽粒中的表達量顯著低于在73014-336、8399/3/4和7929/1/6成熟籽粒中的表達量,而AnVin-2D基因在4種不同籽粒硬度裸燕麥品種中的表達量無明顯差異。AnVin-2A在成熟籽粒中未能擴增到。

A圖中a、b和c分別表示 AnVin-2C、 AnVin-2D和內參基因Ta2776在燕麥籽粒7個發育時期的表達豐度,M:DL2000;1:開花后1 d;2:開花后7 d;3:開花后14 d;4:開花后21 d;5:開花后28 d;6:開花后35 d;7:成熟期。B圖中a、b和c分別表示 AnVin-2C、 AnVin-2D和內參基因Ta2776在4個不同裸燕麥品種成熟籽粒的表達豐度,M:DL2000;1:73014-336;2:8399/3/4;3:冀雜二號;4:7929/1/6。

3 討 論

研究表明,小麥的籽粒硬度是由Ha位點的主效基因Gsp-1、Pina和Pinb控制[14],大麥是由Hordoindoline(HIN)基因控制[15],普通栽培燕麥是由Vin基因控制[11]。Bhave等[16]和Kumar等[14]已經證明了Pin突變類型與小麥籽粒硬度具有相關性,Pina和Pinb基因單獨或同時突變會導致小麥籽粒硬度發生改變,常見的Pin突變類型是編碼序列中的點突變,導致單個氨基酸或者無義等位基因的替換。而大麥HIN基因的等位變異間均具有保守的10個半胱氨酸骨架及TRD區域,且等位變異HINa和HINb-1之間的表達也沒有差異,因而推測HINa和HINb-1等位變異引起的氨基酸差異并不影響籽粒硬度[17]。關于普通栽培燕麥Vin基因突變類型對裸燕麥籽粒硬度的影響還不明確。

基因家族的起源和分化是生物進化領域的重要研究內容,基因家族成員源于同一個祖先基因,因此在結構和功能上具有很多相似性,可編碼功能相似的蛋白產物?；驈椭茷樾禄虻漠a生提供了可能。生物在進化中相對保守,直系同源基因間的功能區別不大,而旁系同源基因間的功能比較容易發生改變[18-19]。普通栽培燕麥AnVin-2的同源基因還有AnVin-1和AnVin-3[15],本課題組在裸燕麥中也克隆得到了AnVin-1和AnVin-3基因(未發表)。AnVin基因對籽粒硬度的影響以及是否存在累加或功能冗余效應,還有待進一步探究。

本研究發現,AnVin-2C4基因在10份不同籽粒硬度裸燕麥品種中存在5種等位變異,其中AnVin-2C4-5編碼的第78位氨基酸由亮氨酸突變為纈氨酸,纈氨酸和亮氨酸均為脂肪族、非極性、中性氨基酸,推測不會改變蛋白質的功能;AnVin-2C4-4編碼的第22位氨基酸由纈氨酸突變為丙氨酸,纈氨酸和丙氨酸也均為脂肪族、非極性、中性氨基酸,推測也不會改變蛋白質的功能,第34位氨基酸由非極性的丙氨酸突變為極性的絲氨酸,可能會導致蛋白質的結構、親疏水性發生變化,進而影響蛋白質的功能。等位基因AnVin-2C4-1、AnVin-2C4-2和AnVin-2C4-3編碼的氨基酸均為無義突變,但是否改變蛋白質的功能還有待進一步研究。

對裸燕麥籽粒中AnVin-2基因的表達模式分析發現,AnVin-2C和AnVin-2D基因的表達量隨著籽粒的發育而發生變化,均在開花后21 d表達量達到峰值,之后逐漸下降,在成熟期趨于穩定;但對不同硬度裸燕麥的成熟籽粒中表達量分析發現,AnVin-2C基因在在冀雜二號成熟籽粒中的表達量顯著低于在73014-336、8399/3/4和7929/1/6成熟籽粒中的表達量,而AnVin-2D基因在4種不同籽粒硬度裸燕麥品種中的表達量無顯著差異,原因可能是AnVin-2C的遺傳背景不一致,在各品種間具有表達差異。AnVin-2A基因在裸燕麥籽粒各個發育階段均未檢測到。另外,籽粒硬度除了受遺傳因素的影響以外,還與淀粉、脂質和蛋白的結合程度有關[9, 20],但仍需進一步研究。