納豆菌發(fā)酵海參制備的多糖抗氧化活性分析

鞠念衡，劉 爽，韓之一，李雙雙，趙前程，3，4，李 瑩，3，4*

(1.大連海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 大連 116023；2.大連鑫玉龍海洋生物種業(yè)科技股份有限公司，遼寧 大連 116299；3.大連民族大學(xué)生物技術(shù)與資源利用教育部重點實驗室，遼寧 大連 116600；4.遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點實驗室，遼寧 大連 116023)

海參被譽為“海八珍”之首，是一種高端食材，其保健功效受到廣泛認可[1]。目前市場上的海參加工品技術(shù)含量低，同質(zhì)化程度高。而現(xiàn)有的海參精深加工品以酶解技術(shù)制備海參肽為主，高品質(zhì)、高附加值的產(chǎn)品仍然匱乏[2]，目前市場上也沒有發(fā)酵海參類產(chǎn)品。同時，研究發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)過多的自由基會破壞生物膜，產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，引起多種疾病[3]。海參多糖是海參中重要的功能成分，已被證實具有清除人體內(nèi)自由基的抗氧化活性[4]。

近些年益生菌市場火熱，納豆菌是一種高產(chǎn)蛋白酶的益生菌，能夠有效地降解大分子蛋白質(zhì)，促進營養(yǎng)物質(zhì)的吸收利用，并能很好地定殖于腸道，改善腸道微生態(tài)[5-6]。利用納豆菌發(fā)酵海參開發(fā)新型海參精深加工品，將有利于促進海參加工產(chǎn)業(yè)升級轉(zhuǎn)型，但發(fā)酵過程伴隨著復(fù)雜的物質(zhì)轉(zhuǎn)化，發(fā)酵前后海參多糖的含量及活性的變化對發(fā)酵工藝在海參加工中的應(yīng)用具有一定的影響。因此，本文采用分光光度法測定發(fā)酵海參制備的多糖和海參多糖的羥自由基(·OH)清除能力、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)自由基清除能力、2，2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)自由基清除能力和鐵還原能力，有針對性地對比納豆菌發(fā)酵海參制備的多糖和海參多糖抗氧化活性，為開發(fā)新型發(fā)酵海參精深加工產(chǎn)品提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

實驗所用海參為仿刺參(Apostichopusjaponicus)，購自大連財神島集團有限公司；無水葡萄糖、DPPH、維生素C(VC)、乙二胺四乙酸(EDTA)、氯化十六烷基吡啶(CPC)、三水乙酸鈉、半胱氨酸、亞鐵氰化鉀等，購自天津市大茂化學(xué)試劑廠；木瓜蛋白酶，購自索萊寶科技有限公司。

千分之一精密電子天平：濟寧市裕澤工業(yè)科技有限公司；高壓蒸汽滅菌鍋：山東創(chuàng)美機械科技有限公司；FC3酶標儀：賽默飛世爾科技公司；恒溫培養(yǎng)搖床：上海川一實驗儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 海參多糖的提取

參照Xiong Q等[7]的方法并稍加改動，進行多糖的提取。在100.00 g海參粉中加入4.38 g EDTA、40.80 g三水乙酸鈉、2.36 g半胱氨酸、10.00 g木瓜蛋白酶、3 L蒸餾水，充分混勻后60°C水浴反應(yīng)24 h。離心后取上清液并加入10%CPC溶液，室溫下放置24 h；離心取沉淀，將其溶解于1.5 L 2 mol/L NaCl∶乙醇(VNaCl∶V乙醇=100∶15)溶液中，在混合溶液中加入3倍體積95%的無水乙醇，4°C靜置過夜；取下層沉淀，用乙醇洗滌3次，采用6 000～8 000 Da透析袋進行透析，凍干即得海參多糖。

1.2.2 發(fā)酵海參制備的多糖的提取

取試管斜面上的納豆芽孢桿菌，接種至LB液體培養(yǎng)基，35°C培養(yǎng)過夜，作為種子液(菌體濃度約為109CFU/mL)，以4%接種量接種至海參發(fā)酵培養(yǎng)基(海參粉3.5 g/L，葡萄糖7.5 g/L，121°C高壓蒸汽滅菌后備用)，35°C發(fā)酵48 h。發(fā)酵海參制備的多糖的提取方法同1.2.1海參多糖的提取。

1.2.3 多糖組成成分的測定

采用苯酚硫酸法測定發(fā)酵海參制備的多糖和海參多糖的總糖含量[8]；采用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量[9]；采用高溫煅燒法測定灰分含量[10]。

1.2.4 DPPH自由基清除率的測定[11]

配制濃度為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL多糖溶液與VC溶液，分別吸取2 mL不同濃度發(fā)酵海參制備的多糖溶液和海參多糖溶液，加入2 mL避光保存的0.1 mmol/mL DPPH溶液，充分混合均勻，于25°C水浴條件下，避光反應(yīng)30 min，在517 nm波長下測定吸光值(Optical density，OD)，以VC作為陽性對照。

(1)

式(1)中：a1為2 mL蒸餾水與2 mL 0.1 mmol/mL DPPH溶液反應(yīng)的OD值；b1為2 mL樣品與2 mL 0.1 mmol/mL DPPH溶液反應(yīng)的OD值；c1為2 mL樣品與2 mL 95%乙醇反應(yīng)的OD值。

1.2.5 羥自由基清除率的測定[12]

配制濃度為2、4、6、8和10 mg/mL的多糖溶液與VC溶液，分別吸取1 mL不同濃度發(fā)酵海參制備的多糖溶液和海參多糖溶液，依次加入3 mL 2 mmol/L FeSO4溶液、3 mL 6 mmol/L水楊酸溶液和3 mL 1 mmol/L H2O2溶液，充分混勻后，于37°C水浴條件下反應(yīng)30 min，在510 nm波長下測定OD值，以VC作為陽性對照。

(2)

式(2)中：a2為以蒸餾水為空白對照的OD值；b2為樣品的OD值；c2為以蒸餾水代替H2O2溶液作為本底的OD值。

1.2.6 鐵還原力的測定[13]

配制濃度為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL的多糖溶液與VC溶液，分別吸取不同濃度發(fā)酵海參制備的多糖溶液和海參多糖溶液0.2 mL，加入0.5 mL PBS緩沖液(0.2 mol/L，pH=6.6)和1%亞鐵氰化鉀溶液0.2 mL，在60°C水浴中處理30 min，水浴后，加入1 mL 10%三氯乙酸溶液并離心。取0.5 mL上清液，加入0.1 mL 0.1%的三氯化鐵溶液，再加入0.5 mL蒸餾水，充分混勻后靜置10 min，在700 nm波長下測定OD值，以VC作為陽性對照。

鐵還原力=a3-b3

(3)

式(3)中：a3為樣品的OD值；b3為以蒸餾水為空白對照的OD值。

1.2.7 ABTS自由基清除能力測定[14]

配制濃度為0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL的多糖溶液與VC溶液，分別吸取0.5 mL不同濃度發(fā)酵海參制備的多糖溶液和海參多糖溶液，加入0.8 mL ABTS溶液，充分混勻后靜置6 min，在700 nm波長下測定OD值，以VC作為陽性對照。

(4)

式(4)中：a4為樣品的OD值；b4為以無水乙醇為空白對照的OD值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均設(shè)置3個平行，數(shù)據(jù)處理采用Excel 2010進行統(tǒng)計學(xué)分析，P<0.05為差異顯著；畫圖采用OriginPro 8.5.1軟件。

2 結(jié)果與分析

2.1 發(fā)酵海參制備的多糖和海參多糖的組成成分分析

對發(fā)酵海參制備的多糖和海參多糖進行提取，分析發(fā)酵海參制備的多糖和海參多糖的組成成分，結(jié)果如表1所示。發(fā)酵海參制備的多糖和海參多糖蛋白質(zhì)含量分別為14.87%和13.64%，總糖含量分別為51.91%和49.09%，發(fā)酵海參制備的多糖和海參多糖的組成成分無顯著性差異(P>0.05)。

表1 發(fā)酵海參制備的多糖和海參多糖的成分分析Tab.1 The composition analysis of polysaccharide from fermented sea cucumber and sea cucumber

2.2 DPPH自由基清除能力比較

由圖1可以看出，VC在較低的濃度下就表現(xiàn)出很強的DPPH自由基清除能力，海參多糖與發(fā)酵海參制備的多糖的DPPH自由基清除能力均隨多糖濃度的升高而增強，呈明顯的量效關(guān)系，但是均顯著低于VC(P<0.05)。在多糖濃度為1.0 mg/mL時，海參多糖與發(fā)酵海參制備的多糖的DPPH自由基清除能力分別為73.92%和38.11%，發(fā)酵海參制備的多糖對DPPH自由基的清除能力顯著低于海參多糖(P<0.05)。海參多糖的抗氧化活性與其結(jié)構(gòu)息息相關(guān)，分子量降低可能降低其抗氧化活性，有研究表明，大分子量的海地瓜粗多糖在同等濃度下表現(xiàn)出最強的DPPH自由基和羥自由基清除能力[4]，推測發(fā)酵降低了海參多糖的分子量，因而發(fā)酵海參制備的多糖的DPPH自由基清除能力降低。

2.3 羥自由基清除能力比較

由圖2可以看出，VC在較低的濃度下就表現(xiàn)出很強的羥自由基清除能力，發(fā)酵海參制備的多糖和海參多糖的羥自由基清除能力均隨多糖濃度的升高而增強，呈明顯的量效關(guān)系，但是均顯著低于VC(P<0.05)。在多糖濃度為1.0 mg/mL時，海參多糖與發(fā)酵海參制備的多糖的羥自由基清除能力分別為51.72%和45.94%，發(fā)酵海參制備的多糖對羥基自由基的清除能力顯著低于海參多糖(P<0.05)。分子量與DPPH自由基和羥自由基清除能力成反比，推測發(fā)酵降低了海參多糖的分子量，導(dǎo)致發(fā)酵海參制備的多糖的羥自由基清除能力降低。秦裕景等[15]的研究表明，在濃度為4 mg/mL時，VC和從球參中分離出的粗多糖PPP的羥自由基清除率分別為95.14%和30.76%。本文發(fā)酵海參制備的多糖和海參多糖羥自由基清除率雖然低于VC，但高于球參的羥自由基清除率。

2.4 鐵還原力比較

由圖3可以看出，當濃度為0.2～0.4 mg/mL時，VC的鐵還原能力隨濃度的增加而顯著增強(P<0.05)，在0.4 mg/mL之后逐漸趨于飽和。發(fā)酵海參制備的多糖和海參多糖的鐵還原能力均接近于0，說明發(fā)酵海參制備的多糖和海參多糖均沒有鐵還原能力，而且兩者之間無顯著性差異(P>0.05)。魏婉露對扇貝廢棄液粗多糖的鐵還原力進行研究，結(jié)果表明其鐵還原力為0.148，僅為VC鐵還原力的10%[16]。海參多糖與扇貝廢棄液粗多糖同樣具有糖醛酸，推測含糖醛酸的多糖普遍不具有鐵還原力。

2.5 ABTS自由基清除能力比較

由圖4可以看出，在較低的濃度下，VC的ABTS自由基清除能力就接近95%。隨著濃度的增加，發(fā)酵海參制備的多糖和海參多糖的ABTS自由基清除率也隨之升高，在濃度為1.0 mg/mL時，海參多糖和發(fā)酵海參制備的多糖的ABTS清除率分別為9.57%和14.90%，發(fā)酵海參制備的多糖對ABTS自由基的清除能力顯著大于海參多糖(P<0.05)。多糖的ABTS自由基清除能力與其含有的官能團有著密切的關(guān)系，如羧基或乙酰基[17]，推測發(fā)酵使海參多糖的官能團發(fā)生改變，因此發(fā)酵海參制備的多糖的ABTS自由基的清除能力較未發(fā)酵的高。

3 結(jié)論

納豆菌發(fā)酵海參制備的多糖和海參多糖均有抗氧化活性，但程度不同，其中發(fā)酵海參制備的多糖的羥自由基清除能力和DPPH自由基清除能力低于海參多糖，ABTS自由基清除能力高于海參多糖；兩種多糖均沒有鐵還原能力。發(fā)酵海參制備的多糖和海參多糖的含量及組成無明顯變化，發(fā)酵海參制備的多糖仍具有一定抗氧化活性，說明發(fā)酵可以用于海參加工。本研究為新型發(fā)酵海參精深加工產(chǎn)品的開發(fā)與應(yīng)用提供了科學(xué)依據(jù)。