3 種抗氧化劑處理對干制鲅魚脂肪氧化和 揮發性風味成分的影響

葛迎港，崔柯鑫，陳 慧,2，劉 楠，孫 永，席 瑞，王大軍，周德慶，孫國輝,

（1.中國水產科學研究院黃海水產研究所，青島海洋科學與技術試點國家實驗室海洋藥物與生物制品功能實驗室， 山東 青島 266071；2.上海海洋大學食品學院，上海 201306；3.煙臺海裕食品有限公司，山東 煙臺 264000）

藍點馬鮫（Scomberomorus sierra）又稱鲅魚，屬鱸形目、鯖科、馬鮫屬[1]，富含優質蛋白質、礦物質、不飽和脂肪酸、硒、VB12等多種營養成分[2-3]，是中國北方沿海地區最常食用的海洋魚類之一。一般新鮮的鲅魚會在每年9—12月集中上市，因極易腐爛變質，保鮮貯藏成為影響其市場流通和價格的重要因素。除低溫冷凍貯藏外，沿海居民通常還會采用傳統晾曬法制備干制鲅魚，達到延長保質期和改善風味的目的。但是，魚肉在干制和貯藏過程中必然受到光照、金屬離子和微生物的影響，發生脂肪和蛋白質的氧化變質[4]，生成活潑羰基化合物、小分子醛酮化合物及生物胺等[5-6]，從而導致干制鲅魚品質的下降。因此，探究抑制鲅魚干制過程中脂肪氧化和關鍵風味成分改變的加工工藝顯得十分必要。

在食品加工中添加抗氧化劑是有效延長食品貯藏期的方式。許多天然抗氧化劑本身攜帶的風味物質會對水產品本身的風味產生較大影響，不利于探究加工過程中風味的變化。奎諾二甲基丙烯酸酯（trolox）是一種水溶性維生素衍生物，因其高抗氧化活性被廣泛應用于抑制細胞氧化損傷、緩解氧化應激反應、油脂抗氧化等領域[7]， 雖在我國未被允許添加在食品中，但國外已有應用于食品的研究，如用于降低光照下牛乳中核黃素的損失[8]、抑制鹵制食品中膽固醇氧化[9]和作為其他抗氧化劑的對照抗氧化劑。L-半胱氨酸（L-cysteine，L-Cys）是生物體內一種含硫氨基酸，在GB 2760—2014《食品安全國家標準 食品添加劑使用標準》中被允許以香料形式添加在食品中，賦予食品厚味，因具有抗氧化活性而被廣泛應用于食品工業[10]，如Ning Cheng等[11]在研究腌制香腸時發現，添加L-Cys等氨基酸混合物不僅可以改善香腸色澤，還能降低亞硝酸鹽的殘留量。然而，有關抗氧化劑對干制魚制品揮發性風味成分的影響鮮有報道。

為進一步探究抗氧化劑浸泡處理在魚肉干制過程中對脂肪氧化和關鍵風味成分的影響，本研究選用新鮮鲅魚為原料，采用叔丁基對苯二酚（tertbutylhydroquinone，TBHQ）、L-Cys、Trolox 3 種不同抗氧化劑浸泡處理結合傳統腌制與晾曬工藝，制備干制鲅魚樣品。通過對魚肉pH值、酸價（acid value，AV）、 過氧化值（peroxide value，POV）、丙二醛（malonaldehyde，MDA）含量、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）自由基清除能力、揮發性成分和關鍵風味成分相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）的分析，研究抗氧化劑浸泡處理對干制鲅魚脂肪氧化和風味的影響，為傳統干制鲅魚產品的品質改善提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

新鮮鲅魚（體質量1.2～1.5 kg/尾），購于青島市瑯琊港碼頭。

食鹽（食品級） 中鹽公司；MDA標準品（純 度≥98%） 上海源葉生物科技有限責任公司；TBHQ、Trolox、L-Cys 北京謹明生物科技有限公司；甲醇（色譜純） 瑞典Oceanpak公司；DPPH 美國Sigma公司；其他試劑均為分析純，由國藥集團提供。

1.2 儀器與設備

T18DS25高速均質機 德國IKA儀器公司； UV 1102II紫外分光光度計 上海天美科學儀器有限公司；7980A/5975C氣相色譜-質譜聯用儀、1260 Infinity高效液相色譜儀 美國Agilent公司；BS224S電子天平 北京賽多利斯儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

將新鮮的鲅魚采用傳統“蝶式”切法從背部縱切[12]， 去除內臟與魚鰓，經清水洗凈后室溫下瀝干；之后按料液比1∶1（m/V）將鲅魚加入5 g/100 mL的食鹽水溶液中，在4 ℃條件下腌制12 h；實驗組參照GB 2760—2014在食鹽水溶液中按魚肉質量的0.02%加入TBHQ、Trolox和L-Cys，對照組則不添加任何抗氧化劑；腌制完成后，采用傳統方式自然晾曬5 d，然后將制備的干制鲅魚裝入自封袋，-18 ℃貯藏備用。貯藏30 d后，分別取腹、背、尾部分切碎混勻，用于后續實驗分析。

1.3.2 pH值測定

采用GB 5009.237—2016《食品安全國家標準 食品pH值的測定》中pH計法測定。

1.3.3 AV測定

采用GB 5009.229—2016《食品安全國家標準 食品中酸價的測定》中冷溶劑指示劑滴定法測定。

1.3.4 POV測定

采用GB 5009.227—2016《食品安全國家標準 食品中過氧化值的測定》中滴定法測定。

1.3.5 MDA含量測定

采用GB 5009.181—2016《食品安全國家標準 食品中丙二醛的測定》中的高效液相色譜法測定。

1.3.6 DPPH自由基清除率測定

參照Serpen等[13]的方法，將魚肉與水按料液比1∶9（m/V） 混合勻漿，經雙層濾紙過濾后5000 r/min離心30 min，取上清液即為樣品液。將2.00 mL樣品液和2.00 mL 0.20 mmol/L DPPH溶液快速振蕩搖勻，在37 ℃下避光反應30 min，之后在517 nm波長處測定吸光度。DPPH自由基清除率按照公式（1）計算。

式中：A樣為加入樣品的吸光度；A對為用等量蒸餾水代替樣品液的吸光度；A空為無水乙醇取代DPPH溶液的吸光度。

1.3.7 揮發性成分測定

采用固相微萃取-氣相色譜-質譜法進行測定。參照Yu Haiyan等[14]的方法，稍作修改。萃取方法：稱取5.00 g粉碎的干制鲅魚樣品置于20.00 mL頂空瓶中，在60 ℃中水浴5 min，將固相微萃取針插入頂空瓶中萃取30 min后進樣，在進樣口解吸5 min。色譜條件：色譜柱：HP-INNOWAX毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm），載氣為氦氣，流速1.00 mL/min，分流比5∶1，進樣溫度250 ℃；升溫程序：起始溫度40 ℃，保持5 min，以80 ℃/min升至250 ℃，保持5 min。質譜條件：電子轟擊電離源，能量70 eV；離子源溫度230 ℃，四極桿溫度150 ℃，接口溫度250 ℃，掃描范圍為m/z30～400。 數據處理：將魚肉揮發性成分的氣相色譜-質譜譜圖與NIST 14.0質譜庫進行對比，依據匹配度（≥80%）和保留指數定性，將面積歸一化，以此計算每一種揮發性風味物質的相對含量。

1.3.8 關鍵風味物質分析

ROAV法通常用來評價各揮發性成分對樣品總體風味的貢獻程度。當0.1≤ROAV＜1時，即判定該成分對干制鲅魚的總體風味具有重要修飾作用；當ROAV≥1時，即判定該成分是干制鲅魚的關鍵風味成分；當ROAVmax=100時，即判定該成分為對總體風味貢獻最大的成分[15]。ROAV按照公式（2）計算。

式中：Cmax和Tmax分別為對干制鲅魚總體風味貢獻最大成分的相對含量及其感覺閾值/（mg/kg）；Ci和Ti分別為其他各揮發性成分的相對含量及其感覺閾值/（mg/kg）。

1.4 數據處理

以上實驗每組均重復3 次，利用Origin 21.0軟件作圖，除ROAV外，實驗數據均以平均值±標準差表示。利用SPSS 25.0軟件記錄和分析數據，通過最小顯著差異法進行顯著性差異分析（P＜0.05）。

2 結果與分析

2.1 3 種抗氧化劑對干制鲅魚pH值的影響

魚在被宰殺初期會發生自溶與肌肉僵直現象[16]，乳酸引起pH值下降，后期隨著微生物生長繁殖和蛋白質分解產物積累，pH值又開始逐漸上升[17]。由圖1可知，鲅魚魚肉經過干制和貯藏后，其pH值為5.97～6.07，與目前市場干制魚產品的pH值較為接近[5]。抗氧化劑處理組的pH值低于對照組，這與抗氧化劑會影響微生物代謝活動有關。此外，L-Cys具有酸性，也是該組pH值顯著低于TBHQ組和Trolox組的原因。

2.2 3 種抗氧化劑對干制鲅魚脂肪氧化的影響

衡量魚肉脂肪氧化的3 個重要指標為AV、POV、MDA含量。AV表示肉制品中游離脂肪酸的含量，AV越高代表脂肪水解程度越高，游離脂肪酸含量越高；POV表示不飽和脂肪酸中不飽和鍵與氧氣結合生成過氧 化物的程度；MDA是不飽和脂肪酸氧化分解的最終產物之一[18]。

由圖2A可知，添加抗氧化劑處理的干制鲅魚脂肪氧化程度顯著低于對照組（P＜0.05）。與對照組相比，各實驗組的AV均顯著下降，對脂肪氧化表現出較好的抑制效果，其中L-Cys組效果最優，AV下降至（2.15±0.03） mg/g，這與L-Cys會影響環境中H＋濃度有關。脂肪體外模擬消化表明，隨著腸道pH值下降，脂肪水解速率不斷下降[19]，這與魚肉pH值的測定結果保持一致。由圖2B可知，TBHQ組和Trolox組對脂肪過氧化物的生成表現出較好的抑制效果，其POV均降至（0.29±0.04） g/100 g，這是由于TBHQ和Trolox具有細胞滲透性，能進入脂肪細胞內部更好地抑制脂肪氧化分解。由圖2C可知，相比對照組，TBHQ組、Trolox組、L-Cys組中MDA含量分別下降（66.68±1.05）、（86.31±1.75）、（80.37±1.11） mg/kg，這與抗氧化劑通過螯合金屬離子抑制魚肉脂肪氧化密切相關[4,20-21]。

圖2 不同抗氧化劑處理對干制鲅魚AV（A）、POV（B）和 MDA含量（C）的影響Fig. 2 Effects of different antioxidant treatments on AV (A), POV (B) and MDA content (C) of dry-cured Spanish mackerel

2.3 3 種抗氧化劑對干制鲅魚DPPH自由基清除能力的影響

脂肪氧化程度與自由基清除能力呈負相關，通過抗氧化處理提高魚肉的DPPH自由基清除能力是延長貯藏時間的重要途徑[22]。由圖3可知，實驗組的DPPH自由基清除率至少提高9.80%；其中，Trolox組魚肉的抗氧化性最強，DPPH自由基清除率達到（94.84±1.65）%，其次為TBHQ組和L-Cys組，分別達到（92.09±2.39）%和（91.41±1.06）%，這與抑制脂肪氧化的結果相一致。Trolox組自由基清除能力最強，與Trolox與自由基反應為親電加成反應[23]而TBHQ和L-Cys為親電取代反應有關。

圖3 不同抗氧化劑處理對干制鲅魚DPPH自由基清除能力的影響Fig. 3 Effects of different antioxidants on DPPH radical scavenging ability of dry-cured Spanish mackerel

2.4 3 種抗氧化劑對干制鲅魚揮發性成分的影響

由表1可知，TBHQ組中檢出30 種揮發性物質，包括3 種醇類、3 種芳香族類、3 種含氮含硫類、2 種醚類、5 種醛酮類、3 種羧酸類、4 種烷烴類和7 種酯類，其中醇類相對含量最高，其次為含氮含硫類，再次為烷烴類，其他類化合物未檢出。Trolox組中檢出44 種揮發性物質，包括3 種醇類、10 種芳香族類、1 種醚類、4 種醛酮類、3 種羧酸類、12 種烷烴類、3 種其他類化合物和8 種酯類，其中酯類相對含量最高，占揮發性物質總量的59.09%，芳香族類和烷烴類共占29.96%。L-Cys組中檢出51 種揮發性物質，包括6 種醇類、4 種芳香族類、5 種含氮含硫類、1 種醚類、9 種醛酮類、1 種羧酸類、17 種烷烴類、1 種其他類化合物和7 種酯類，其中以烷烴類為主，醇類、含氮含硫化合物、醛酮類和酯類占52.67%。對照組中檢出39 種揮發性物質，包括8 種醇類、3 種芳香族類、4 種含氮含硫類、1 種醚類、14 種醛酮類、1 種羧酸類、5 種烷烴類、1 種其他類化合物和2 種酯類，其中醛酮類含量最高，含氮含硫類次之，再次為烷烴類與醇類。抗氧化劑處理使魚肉揮發性成分中酯類相對含量明顯上升，醛酮類和含氮含硫類相對含量明顯下降。

表1 不同抗氧化劑處理后干制鲅魚的揮發性成分測定結果Table 1 Volatile components of dry-cured Spanish mackerel treated with different antioxidants

干制魚制品的風味物質主要來源于微生物代謝[24]、脂質氧化分解[25]以及氨基酸降解[26]形成的醛類、酯類、一元胺等，特別是低閾值的低級醛對特殊風味的形成尤為重要[27]。與對照組相比，TBHQ組、Trolox組、L-Cys組的醛類相對含量分別降低87.41%、92.49%、51.98%，其中對干制鲅魚風味有貢獻的醛類相對含量分別為3.26%、2.05%、12.59%，與對照組（19.88%）相比也發生明顯下降。與TBHQ組、Trolox組相比，L-Cys組保留了賦予傳統干制鲅魚水果香氣和草本香氣的苯乙醛、反-2,4-庚二烯醛、庚醛、己醛、壬醛、辛醛等物質，新增了順-3,6-壬二烯醛、反-3,5-辛二烯-2-酮2 種芳香物質，這與氨基酸降解會促進醛類化合物的形成有關。同時，TBHQ組、Trolox組羧酸類物質相對含量分別為5.82%、3.27%，這類物質具有刺激性和不愉快氣味，被認為對風味的形成不利。

三甲胺是魚肉不良風味的主要來源，由蛋白質經過內源蛋白酶和微生物代謝產生[28]，其中，Trolox組中并未檢出，L-Cys組中三甲胺相對含量下降70.71%，而TBHQ組中相對含量未發生顯著變化。二甲基氰胺、三甲基-1,3-丙二胺、N-二甲氨基甲基-N-甲基甲酰胺3 種物質僅存在于L-Cys組中，可能是由L-Cys氧化分解形成的。

酯類來源于醇類與酸類的酯化反應，是果香味、甜味、花香味的來源，有助于干制樣品形成獨特風味。經過抗氧化劑處理后，酯類相對總量分別為：TBHQ組9.35%、Trolox組59.09%、L-Cys組12.47%、對照組2.14%。其中，TBHQ組中含有特殊芳香氣味的酯類相對含量為5.98%，略高于L-Cys組的3.90%；在Trolox組中，鄰苯二甲酸二異丁酯、鄰苯二甲酸二甲酯、鄰苯二甲酸二丁酯、鄰苯二甲酸二乙酯等含量占揮發物總量的53.78%，但是這類物質氣味強度低[29-30]，存在體內代謝安全隱患，且對干制鲅魚風味的形成貢獻較小，而具有特殊芳香氣味的酯類相對含量僅為2.03%。

醇類可由脂質氧化形成，可以為魚肉提供花香與水果香氣。飽和醇閾值較高，對風味貢獻較小，不飽和醇的閾值較低。經抗氧化劑處理后各組醇類相對含量分別為：TBHQ組41.62%、Trolox組3.36%、L-Cys組11.65%、對照組16.33%。其中，TBHQ組的乙醇相對含量達35.25%，這可能與TBHQ使用乙醇作為溶劑有關；而在對照組和L-Cys組中均檢出較高含量的1-辛烯-3-醇，其來源于亞油酸氫過氧化物降解，賦予干制鲅魚特有的蘑菇香氣和咸肉湯口味，Trolox組和TBHQ組未檢出的原因是其對脂肪氧化中過氧化物的生成有更強的抑制作用，這與前文對脂肪氧化的研究結果一致。

烷烴類物質主要來源于類胡羅卜素分解和脂肪的自動氧化，其閾值較高，對風味的貢獻小。僅在L-Cys組和對照組中檢出具有脂肪香氣的苯乙烯，Trolox組和TBHQ組中均未檢出具有香氣的烷烴類物質。

由以上分析可知，經過抗氧化劑浸泡處理，干制鲅魚的揮發性成分發生明顯改變；添加L-Cys有利于降低干制鲅魚中不良風味物質的形成，保留更多具有芳香氣味的不飽和醇與醛酮類物質。Trolox和TBHQ使魚肉中酯類化合物增加，但多為閾值較高的酯類化合物，并不能為干制鲅魚特殊風味形成作出貢獻。相對而言，經L-Cys處理后的干制鲅魚揮發性風味成分最接近對照組，保留了更多傳統干制鲅魚的天然風味。

2.5 3 種抗氧化劑對干制鲅魚關鍵揮發性風味成分的影響

在魚肉眾多揮發性物質中僅有部分對風味有貢獻作用。由表2可知，不同抗氧化劑處理干制鲅魚ROVA存在明顯差異，在TBHQ組、Trolox組、L-Cys組和對照組中，干制鲅魚分別含有關鍵風味成分11、3、11、13 種，且對風味貢獻最大的成分分別為正己酸乙酯、癸醛、壬醛和苯乙烯，與Wu Siliang等[26]對干腌鲅魚關鍵風味成分的研究結果相似，同時這些物質也是低鹽發酵酸魚[29]、發酵鱖魚[31]及發酵蝦醬[32]中的關鍵風味成分。在TBHQ組，正己酸乙酯、苯乙醇、3-甲基-1-丁醇、3-甲基丁醛是酒精加工過程中副產物，是使用酒精作為溶劑被引入；Trolox組中苯并噻唑主要來源于美拉德反應中二羰基化合物與硫胺素和脂質的降解反應生成。造成實驗組干制鲅魚中醛酮類和醇類關鍵風味成分減少的原因除抗氧化劑抑制魚肉中物質氧化分解外，還與酚類抑制魚肉中內源酶活性[33]、Trolox改變微生物的體內代謝水平 有關[34]。但與對照組相比，L-Cys組中干制鲅魚關鍵風味成分的變化最小，更接近傳統干制鲅魚的風味。

續表2

3 結論

在干制鲅魚加工工藝中，抗氧化劑浸泡處理可以顯著抑制魚肉中脂肪的氧化分解，且對pH值無明顯影響。在抑制魚肉脂肪氧化方面，L-Cys對AV的抑制效果最強，TBHQ和Trolox對POV的抑制效果較好，Trolox和L-Cys對MDA的抑制能力優于TBHQ；抗氧化劑通過影響脂肪氧化進程，進而影響干制鲅魚中揮發性風味物質的變化。與Trolox和TBHQ相比，L-Cys處理可最大程度保留干制鲅魚中揮發性風味物質，明顯降低具有令人不愉快氣味的三甲胺和羧酸類物質含量。綜上所述，0.02%抗氧化劑浸泡處理可明顯抑制干制鲅魚的脂肪氧化，改變特有的揮發性風味物質成分。從食品安全角度和風味而言，L-Cys可以用于取代合成抗氧化劑用于抑制干制魚產品的脂肪氧化和改善風味，為延長干制魚產品的貯存期及提高產品品質提供理論依據。