肉類食品中腸炎沙門氏菌快速檢驗 即用型質控樣品研制

張雅倫，許苗苗，劉雨蒙，祝巖波，嚴陶陶，王 贊，張 捷

（河北省食品檢驗研究院，河北省食品安全重點實驗室，國家市場監管重點實驗室（特殊食品監管技術） 特殊食品安全與健康河北省工程研究中心，河北 石家莊 050071）

沙門氏菌是肉與肉制品中常見的食源性致病菌，常導致感染者胃腸炎、腹瀉，對人類健康產生嚴重危害[1-2]， 其中的腸炎沙門氏菌（Salmonella enteritidis，SE）無特定宿主，主要通過糞便或灰塵進行氣溶膠傳播，是一種重要的人畜共患病原體[3-4]。近幾年，全球范圍內沙門氏菌引起的肉及肉制品食品安全事件頻發[5]。肉制品在從飼養開始的生產過程中，到向屠宰廠的運輸，或屠宰過程中的處理，均存在被沙門氏菌污染的可能[6]。此外，冷鮮店中的肉還存在沙門氏菌交叉污染的風險，污染程度約增加20%[7-9]。數據顯示，我國肉及肉制品中沙門氏菌的檢出率達到1.1%～39.5%[10]。在兩廣、福建和上海地區零售肉類所采集的399 株沙門氏菌中，17.04%的菌株為腸炎沙門氏菌，檢出率最高[11]。在江蘇[12-13]、上海[14-15]、四川[16]、山東[17]等地所采集的鴨肉及其制品中，沙門氏菌的檢出率為20%～48%。四川省眉山市一學校曾爆發 沙門氏菌污染豬肉制品導致的食品安全事件，涉及人數達到386 人[18]。

細菌污染導致的食品安全問題頻發，使得消費者對肉及肉制品中致病菌的檢測也越來越關注?？焖?、準確鑒定食源性微生物是食品微生物檢驗的一項基本要求。常用的傳統培養方法雖然作為檢測沙門氏菌的“金標準”，但耗時費力，且靈敏度低，不能滿足食品行業快速檢測的需求[19]。而后發展起來的聚合酶鏈式反應、環介導等溫擴增等方法雖然具有靈敏度高、特異性強的優點，但大多需要昂貴的反應儀器，或引物設計較為復雜，氣溶膠污染嚴重[20-21]。因此，開發一種快速、準確、操作簡單的檢測肉及肉制品中沙門氏菌的方法具有十分重要的意義?；|輔助激光解吸電離飛行時間質譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是近年來發展的一種新型分析技術，具有前處理簡單和高通量的特點[22-23]。MALDI-TOF-MS可以實現對未知微生物的快速鑒定、分型及溯源等[24-26]，已經被用于快速檢測和鑒定從鮮食蔬菜中分離的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特氏菌和蠟樣芽孢桿菌，以及對沙門氏菌的分型溯源等[27-29]。目前，基于MALDI-TOF-MS檢測沙門氏菌的質控樣品相關報道很少。本研究利用MALDI-TOF-MS技術，擬研制即用型腸炎沙門氏菌陽性質控樣品，并對其應用效果進行驗證。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

腸炎沙門氏菌標準菌株（CMCC 50957） 中國食品藥品檢定研究院。

無水乙醇、甲酸、乙腈（均為質譜純） 天津科密歐化學試劑有限公司；質譜靶標基質液 德國布魯克科技有限公司；平板計數瓊脂（PCA）培養基 北京陸橋技術有限責任公司。

1.2 儀器與設備

MALDI-TOF/TOF 7090質譜儀、MIR-254低溫恒溫培養箱 日本Sanyo公司；ME204電子天平 瑞士Mettler-Toledo公司；3K15臺式離心機 德國Sigma 公司；VITEK 2 Compact全自動細菌鑒定儀 法國生物梅里埃公司。

1.3 方法

1.3.1 即用型腸炎沙門氏菌質控樣品制備及檢測

1.3.1.1 制備過程

保護劑的制備：在超純水中加入蔗糖、葡聚糖、牛血清白蛋白，使其質量濃度分別為15、8、5 g/100 mL。

將腸炎沙門氏菌標準菌株劃線接種于PCA培養基，在36 ℃條件下培養24 h。培養結束后，使用無菌棉簽蘸取菌苔置于生理鹽水中，混懸于凍干保護劑中，調整菌懸液的麥氏濁度至2.5 MCF。然后在西林瓶中放入干燥劑，再加滿液氮，并滴加100 μL菌懸液，放入真空冷凍干燥機。待樣品充分干燥后取出，密封壓蓋冷藏。

1.3.1.2 即用型腸炎沙門氏菌質控樣品

制得腸炎沙門氏菌質控樣品為白色圓球狀，西林瓶密封良好，干燥劑未變色，水分去除完全，符合要求，可繼續進行后續實驗。

1.3.1.3 計數方法

取出未開啟的凍干菌球西林瓶，置于室溫下，開啟前用酒精棉球擦拭鋁塑蓋和膠塞。將凍干菌球轉移至10 mL無菌水中，再進行10 倍梯度稀釋。將稀釋液接種至PCA培養基，置于36 ℃條件下培養24 h，培養結束后進行計數。

1.3.1.4 MALDI-TOF-MS檢驗

取出未開啟的凍干菌球西林瓶，置于室溫下，用酒精棉球擦拭鋁塑蓋和膠塞并開啟。將菌球轉移至離心管后加入100 μL無菌水，振蕩1 min，使其溶解并混勻，12500 r/min離心5 min后棄上清。向所得沉淀中加入100 μL無菌水，重復離心3 次。向最終沉淀中加入50 μL體積分數為70%的甲酸，振蕩2 min，再加入50 μL乙腈，振蕩2 min，最終制得檢測液。吸取1 μL檢測液的上清滴到靶板上，室溫晾干后覆蓋1 μL基質，再次晾干，開始檢測。

在質荷比（m/z）2000～20000進行檢測。根據MALDI-TOF-MS分析得出的特征性質譜圖分析腸炎沙門氏菌裂解后特異性蛋白質或多肽離子峰，實現對檢測菌株的區分和鑒定。

1.3.2 腸炎沙門氏菌質控樣品均勻性研究

隨機抽取腸炎沙門氏菌質控樣品20 瓶，向每瓶加入1 mL生理鹽水，使凍干樣品充分溶解，使用加樣系統涂布接種于PCA培養基，每個樣品進行2 次平行實驗。置于36 ℃培養24 h，培養結束后對計數結果進行統計分析。

1.3.3 腸炎沙門氏菌質控樣品穩定性研究

運輸條件模擬實驗：模擬實驗周期為2 周。將腸炎沙門氏菌質控樣品分別放置于37 ℃培養箱和25 ℃搖床中，分別在0、1、3、5、7、14 d取出質控樣品，每個實驗條件隨機抽取3 個質控樣品，按照1.3.1.3節進行計數，每次計數做3 個平行實驗。對計數結果進行統計分析，評價質控樣品的穩定性。

貯藏條件模擬實驗：模擬實驗周期為4 周。將腸炎沙門氏菌質控樣品分別放置于4 ℃和-20 ℃，分別在0、1、3、5、7、14、28 d取出質控樣品，每個實驗條件隨機抽取3 個質控樣品，按照1.3.1.3節進行計數，每次計數做3 次平行實驗。復蘇率按下式計算。

式中：An為第n天的菌液濃度/（CFU/mL）；A0為 第0天的菌液濃度/（CFU/mL）。

1.3.4 MALDI-TOF-MS穩定性檢驗

分別將樣品在37 ℃和-20 ℃環境下貯藏28 d后進行MALDI-TOF-MS檢驗。將檢測結果導入BN軟件進行分析整合，分析質控樣品MALDI-TOF-MS檢驗穩定性。

1.4 數據處理

使用SPSS軟件，采用單因素方差分析對20 瓶腸炎沙門氏菌質控樣品均勻性檢測結果進行分析。每次平行實驗的計數結果采用平均值±標準差形式表示。

2 結果與分析

2.1 腸炎沙門氏菌質控樣品均勻性檢測結果

對20 瓶質控樣品進行均勻性檢測，由表1可知，樣品計數結果平均值為1.90×108CFU。

表1 20 瓶腸炎沙門氏菌標準物質計數結果Table 1 Counting results of 20 bottles of S. enteritidis reference material108 CFU

使用SPSS軟件，采用單因素方差分析方法，對樣品的均勻性進行檢驗。FINV（0.05，19，20）臨界值=2.137，由表2 可知，根據SPSS軟件計算結果F=0.75＜FINV（0.05，19，20）臨界值，表明在0.05顯著水平下，質控樣品菌株活力無顯著性差異，該樣品符合均勻性要求。

表2 腸炎沙門氏菌質控樣品均勻性實驗結果Table 2 Results of uniformity test of S. enteritidis quality control sample

2.2 腸炎沙門氏菌質控樣品穩定性檢測結果

2.2.1 運輸穩定性實驗

由表3可知，質控樣品貯藏0 d的計數結果為1.81×108CFU，在37 ℃環境下貯藏14 d內，腸炎沙門氏菌質控樣品活菌數量雖然有所下降，但均保持在108CFU水平。同樣，在25 ℃環境下，活菌數量仍在108CFU水平內降低，并且14 d內活菌含量較37 ℃更加穩定，表明該質控樣品可以在運輸中保持菌株數量，穩定性良好。

表3 腸炎沙門氏菌質控樣品模擬運輸條件實驗結果Table 3 Stability of S. enteritidis quality control sample under simulated transport conditions 108 CFU

2.2.2 貯藏穩定性實驗

由表4可知，質控樣品在-20 ℃條件下貯藏28 d后復蘇率為90.6%，4 ℃條件下貯藏28 d后復蘇率為89.0%。2 種貯藏條件下，質控樣品復蘇率均在90%左右，證明菌株在貯藏期間活力降低程度很小。綜上所述，模擬貯藏過程中質控樣品貯藏穩定性良好，可以滿足長期貯藏要求。

表4 腸炎沙門氏菌質控樣品貯藏穩定性實驗結果Table 4 Storage stability of S. enteritidis quality control sample

2.2.3 MALDI-TOF-MS穩定性實驗

由圖1～2可知，不同存放溫度下，MALDI-TOF-MS檢測腸炎沙門氏菌質控樣品結果穩定，譜圖一致，檢測結果并沒有受到存放環境溫度的影響。說明質控樣品MALDI-TOF-MS檢驗穩定性良好，可以作為陽性質控樣品在MALDI-TOF-MS檢驗中使用。

圖1 腸炎沙門氏菌質控樣品在4 ℃條件下的MALDI-TOF-MS譜圖Fig. 1 Mass spectrum of S. enteritidis standard substance stored at 4 ℃

圖2 腸炎沙門氏菌質控樣品在－20 ℃條件下的MALDI-TOF-MS譜圖Fig. 2 Mass spectrum of S. enteritidis standard substance stored at ?20 ℃

3 討 論

MALDI-TOF-MS檢測技術逐漸應用于食源性致病菌檢測的各個方面，如鮑春梅等[30]通過擴充MALDI-TOFMS數據庫的方法進行宋內志賀菌的鑒定；王耀等[31]應用MALDI-TOF-MS采集圖譜，匯總后建立了單增李斯特氏菌的鑒定數據庫；李濱州等[32]利用MALDI-TOF-MS鑒別生鮮豬肉中大腸桿菌和沙門氏菌常規檢驗中出現的類似菌；董青等[33]利用MALDI-TOF-MS技術分離鑒定出鴨源雞桿菌。但目前尚沒有針對腸炎沙門氏菌的陽性參考樣品和即用型質譜鑒定綜合參比體系，并且標準參考樣品尚未實現國產化等問題也成為我國食品中沙門氏菌質譜檢測發展的影響因素。

4 結論

本研究制備的即用型MALDI-TOF-MS腸炎沙門氏菌質控樣品均勻性和穩定性可滿足質控樣品的要求。樣品F=0.75＜臨界值，表明均勻性良好。樣品在25 ℃和37 ℃環境下貯藏14 d后活菌數量穩定，說明質控樣品在運輸過程中的穩定性受溫度影響不大；樣品在-20 ℃和4 ℃環境下貯藏28 d后活菌數量穩定，根據以往經驗，說明質控樣品可以保持長期穩定性。樣品在37 ℃和-20 ℃環境下MALDI-TOF-MS譜圖的一致性保證了樣品可以作為MALDI-TOF-MS質控樣品進行鑒定的穩定性。因此，本研究研制的即用型質控樣品為快速、精準檢測肉類中腸炎沙門氏菌提供了有力的支撐，保證了MALDI-TOF-MS鑒定的準確性。