不同水溫對5 個品系黑鯛抗氧化和免疫因子的影響

倪可雯，孫瑞健，徐大鳳，于雯雯，周堂建，陳淑吟*

（1.水產科學國家級試驗教學示范中心，上海海洋大學，上海 201306；2.江蘇省海洋水產研究所，江蘇 南通 226007）

水溫是開展魚類人工養(yǎng)殖必須監(jiān)測的指標[1-3]，直接影響著魚類生長發(fā)育。水溫變化易引起魚體的生理應激反應[4-5]，導致體內活性氧（ROS）過量產生，造成機體損傷[6-8]。超氧化物歧化酶（SOD）和過氧化氫酶（CAT）等是水生動物清除ROS 的關鍵酶類[9-10]，魚類通過提高這些抗氧化酶活力來應對包括水溫脅迫在內的外部壓力，因而這些酶活的變化，可反映魚類機體受損或應對脅迫的情況[11]。在對中華鱘（Acipenser sinensis）[12]、四指馬鲅（Eleutheronematetradactylum）[13]、云紋石斑魚（Epinephelusmoara）[14]等魚類的研究中發(fā)現，溫度變化超過一定范圍，均顯著影響魚的SOD、CAT 等抗氧化酶活性。堿性磷酸酶（AKP）、血清溶菌酶（LZM）等是魚類重要的免疫相關酶[15]。河豚（Takifugu obscurus）在水溫25 ℃降至13 ℃過程中，AKP 活性顯著降低[16]；不同品系羅非魚（Oreochromis mossambicus）在水溫26 ℃降至20 ℃過程中，LZM 活性顯著上升，且不同品系間的酶活變化存在差異[17]。這些酶活水平的變化態(tài)勢，直接反映了魚體對水溫變化的適應能力及物種特異性。因此，研究水溫脅迫下魚類相關酶活指標的變化，對實際生產具有指導作用。

黑鯛（Acanthopagrus schlegelii）隸屬于鯛科（Sparidae），棘鯛屬（Acanthopagrus），俗稱黑加吉、黑立，是我國南北沿海均可養(yǎng)殖的重要海水經濟魚類[18]。黑鯛作為沿岸性魚類，有著較廣的適溫范圍[19]，但在長江以北養(yǎng)殖時，仍無法在室外越冬，須移入室內。此外，近年來極端高溫天氣頻發(fā)，影響著魚類的正常生長[20]以及產業(yè)的健康發(fā)展[21]。黑鯛適溫范圍廣，是優(yōu)良新種質創(chuàng)制的重要性狀指標。為此開展了不同水溫對不同選育品系黑鯛肝臟抗氧化及免疫因子的影響試驗，以期為黑鯛養(yǎng)殖技術提升和新品系選育研究等提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用魚來自江蘇省海水增養(yǎng)殖技術與種苗中心。5 個黑鯛品系分別為選育系1（XY1），體長均值為（9.68.±0.70）cm，體質量均值為（35.15±8.43）g；選育系2（XY2），體長均值為（10.14±1.35）cm，體質量均值為（39.65±12.94）g；山東群體選育系（XY3），體長均值為（10.89±1.13）cm，體質量均值為（47.90±13.30）g；福建野生群體子一代（YS），體長均值為（10.01±1.16）cm，體質量均值為（36.24±10.67）g；黑鯛♀×真鯛♂雜交子二代新品系（HF2），體長均值為（9.92±0.57）cm，體質量均值為（33.36±5.08）g。

1.2 試驗方法

設置降溫組和升溫組，其中降溫組溫度梯度為17（對照組），13，9 和5 ℃；升溫組溫度梯度為26（對照組），30，34 和38 ℃。每組再根據放養(yǎng)的品系分為5 個黑鯛品系組（XY1、XY2、XY3、YS 和HF2）。各組均設置3 個平行，每個平行分別放養(yǎng)試驗魚30 尾，養(yǎng)殖條件一致。

各試驗組在對照組溫度下暫養(yǎng)一周后取樣并開始試驗，在達到設置溫度養(yǎng)殖12 h 后，隨機取3 尾魚肝臟，迅速放入液氮，后移至-80 ℃冰箱保存，用于酶活性測定。總超氧化物歧化酶（T-SOD）、CAT、LZM 和AKP 等酶活性檢測所用試劑盒，均購自南京建成生物工程研究所，試驗操作嚴格參照說明書。

1.3 數據處理

采用Excel2019 軟件對試驗數據進行處理，結果以（平均值±標準差）表示。采用SPSS19 統(tǒng)計軟件對試驗魚存活及酶活性的影響進行單因素方差分析（One-way ANOVA），通過Duncan 法比較組間差異，若P＜0.05，則為差異顯著。

2 結果與分析

2.1 不同水溫5 個品系黑鯛存活率

水溫為9~34 ℃時，5 個品系的存活率均超過90%；其中13~26 ℃是黑鯛最適溫度，各品系的存活率接近100%；水溫為5 ℃時，品系的存活率有所下降，均低于90%；水溫為38 ℃時，各品系黑鯛存活率均較低，其中存活率最高的HF2品系，也僅為16.9%，YS 品系存活率則最低（表1）。

表1 不同溫度黑鯛5 個品系存活率 %

2.2 不同水溫5 個品系黑鯛肝臟T-SOD 酶活性

降溫組中，水溫為17 ℃時，5 個品系黑鯛肝臟T-SOD 酶活性沒有明顯差異（P＞0.05）。隨著水溫下降，XY1、XY2 和YS 的T-SOD 酶活性先升后降，其中XY1、XY2 在9 ℃時酶活水平達到最大值，YS 品系在13 ℃時酶活水平達到最大值。XY3和HF2的T-SOD 酶活性則表現為隨著水溫下降而逐漸升高。XY3 和HF2在水溫為5 ℃時，TSOD 酶活性顯著高于XY1 和YS（P＜0.05），見圖1（a）。

升溫組中，隨著水溫升高，5 個品系黑鯛肝臟T-SOD 酶活性均呈現先上升后下降的趨勢，在水溫為30 ℃時均達到最大值，且顯著高于其他溫度組（P＜0.05）。就不同品系黑鯛而言，在相同水溫下，5 個品系黑鯛肝臟T-SOD 酶活性有所差異。其中在水溫為26 ℃時，XY3 的T-SOD 酶活性顯著高于其余4 個品系（P＜0.05），在水溫為30 和34 ℃時，XY3 和HF2的T-SOD 酶活性均顯著高于其他3 個品系（P＜0.05）；在水溫為38 ℃時，XY3的T-SOD 酶活性顯著高于另4 個品系（P＜0.05），見圖1（b）。

圖1 不同水溫5 個品系黑鯛肝臟酶T-SOD 活性

2.3 不同水溫5 個品系黑鯛肝臟CAT 酶活性

降溫組中，5 個品系黑鯛肝臟CAT 酶活性均呈先上升后下降的趨勢。在水溫為9 ℃時，各品系CAT 酶活性均達到最大值，且均顯著高于對照組（P＜0.05），其中XY2 的CAT 酶活性最高，且顯著高于XY1、XY3 和HF2（P＜0.05），XY3 的CAT 酶活性最低，且顯著低于其他4 個品系（P＜0.05）。水溫降至5 ℃時，各品系CAT 酶活性出現降低，但顯著高于對照組（P＜0.05），見圖2（a）。

圖2 不同水溫5 個品系黑鯛肝臟酶CAT 活性

升溫組中，5 個品系黑鯛肝臟CAT 酶活性隨水溫升高也呈現先上升后下降的趨勢。除了YS 的CAT 酶活性在水溫為30 ℃時最高，其余4 個品系CAT 酶活性均在水溫為34 ℃時最高。水溫升之38 ℃時，5 個品系的酶活性均出現較大降幅，除了HF2外，其余品系CAT 酶活性均最低，見圖2（b）。

2.4 不同水溫5 個品系黑鯛肝臟AKP 酶活性

降溫組中，隨水溫的降低，5 個品系黑鯛肝臟AKP 酶活性的變化趨勢有所不同。其中XY1、XY2和YS 的AKP 酶活性呈先升高后降低的趨勢，且均在水溫為9 ℃時最高，水溫為17 ℃時最低。XY3和HF2則呈升高趨勢，且均顯著高于對照組（P＜0.05）。在水溫為17，13 和9 ℃時，不同品系黑鯛肝臟AKP 酶活性差異不顯著，在水溫為5 ℃時，XY3 的AKP 酶活性最高，顯著高于XY2 和YS，見圖3（a）。

升溫組中，隨水溫的升高5 個品系黑鯛肝臟AKP 酶活性均呈現先升高后降低的趨勢，其中XY1、XY2 和XY3 的AKP 酶活性均在34 ℃時最高，YS 和HF2的AKP 酶活性均在30 ℃時最高。在對照組中，XY2 的AKP 酶活性最高，與YS 和HF2差異顯著（P＜0.05），與XY1 和XY3 差異不顯著（P>0.05），見圖3（b）。

2.5 不同水溫5 個品系黑鯛肝臟LZM 酶活性

降溫組中，隨水溫的下降，5 個品系黑鯛肝臟LZM 酶活性均呈先上升后下降的趨勢，其均在水溫為13 ℃時最高，且差異顯著（P＜0.05），在水溫為5 ℃時最低。同一溫度下，5 個品系黑鯛肝臟LZM 酶活性均有所差異，但沒有明顯趨勢，見圖4（a）。

升溫組中，隨水溫的升高，YS 的LZM 酶活性先升高后降低，其余4 個品系則均呈上升趨勢。YS 的LZM 酶活性在水溫為30 ℃最高，但其隨水溫的升高下降不顯著（P>0.05）。其余各品系在水溫為38 ℃最高，且顯著高于對照組（P＜0.05）。同一溫度下，5 個品系黑鯛肝臟LZM 酶活性均有所差異，但沒有明顯趨勢，見圖4（b）。

圖4 不同水溫5 個品系黑鯛肝臟酶LZM 活性

3 討論

3.1 溫度變化對5 個品系黑鯛T-SOD 和CAT 活性的影響

魚類體溫每改變1 ℃，其體內的許多生理過程的效率會改變6%~10%[22]。溫度變化影響到魚體內的各種代謝，包括肝臟的抗氧化體系[23-24]。抗氧化酶活性的變化在一定程度上可反映魚體的生理狀況，可作為衡量魚類對外界環(huán)境適宜程度的重要生理指標[25]。SOD 是生物體內清除氧自由基（ROS）的首要物質，能催化超氧陰離子轉化為H2O2和O2的反應。CAT 是清除H2O2的酶，與SOD 協(xié)同維持生物體內氧自由基含量的穩(wěn)定平衡[26]。正常情況下，魚類面臨溫度脅迫時，通過調控升高體內SOD 和CAT 酶活性，對抗與阻斷因應激導致的氧自由基增加，以抵抗不良環(huán)境[27]。黃姑魚（Nibeaalbiflora）[28]、卵形鯧鲹（Trachinotusovatus）[29]、虹鱒（Oncorhynchus mykiss）及硬頭鱒（Steelhead, Salmon Gairdneri）[30]等體內的SOD 和CAT 等抗氧化酶活性，在受到水溫變化的脅迫時，均顯著升高。環(huán)境脅迫超過機體的承受能力時，酶活性則不僅無法再升高，而且還會出現下降趨勢，如白梭吻鱸（Sander lucioperca）在36 ℃時，其SOD 及CAT 活性開始下降[31]；大口黑鱸（Micropterus salmoides）在31 ℃時CAT 活性開始下降[32]。

本試驗降溫組中，XY3 和HF2的T-SOD 酶活性隨水溫的降低逐漸升高，其余品系則呈現先升高后降低的趨勢。其中，YS 的T-SOD 酶活性在13 ℃時達到最大值，XY1 和XY2 在9 ℃時T-SOD 活性值最大。因此，XY3 和HF2在5 ℃時能較好地適應，且其耐受更低水溫。CAT 酶活性的變化與T-SOD有所不同及滯后，各品系均在9 ℃時達到最大酶活。水溫為5 ℃時，5 個品系的T-SOD 和CAT 酶活性均高于對照組，且存活率均>80%，因此5 個品系在水溫為5 ℃時均有較強耐受能力。

升溫組中，水溫升高到30 ℃時，5 個品系T-SOD酶活性均達到最大值，XY2 和YS 的CAT 酶活性也達到最大值。因此，若水溫繼續(xù)升高，這2 個品系抗氧化酶活性將不能提高，進而消除ROS 增加所帶來的損傷。XY1、XY3 和HF2的CAT 酶活性則在34 ℃達到最大值。水溫升至38 ℃后，各品系死亡率均急劇上升，均超過80%，該水溫下T-SOD 和CAT 酶活性也均出現大幅下降。一般而言，酶促反應的適溫范圍要大于魚類正常的生存溫度范圍[22]，因此，認為34 ℃水溫已是大部分黑鯛的承受極限。但各品系中均有部分個體可耐受38 ℃水溫，其中XY3 和HF2存活率高于其他品系。

3.2 溫度變化對5 個品系黑鯛AKP 和LZM 活性的影響

AKP 是生物體免疫功能和健康狀況的參考指標[33]，也是評價動物生理代謝水平的一項重要參數[34]。本試驗的降溫組中，隨著水溫的降低，XY3 和HF2的AKP 酶活性逐漸升高，其余3 個品系則呈先升高后降低的趨勢，且均在水溫為9 ℃時最高，水溫為17 ℃時最低。升溫組中，隨水溫的升高，5 個品系AKP 酶活性均呈現先升高后降低的趨勢。在美洲黑石斑（Centropristis striata）幼魚[35]、施氏鱘（Acipenser Schrenckii）[36]和雙帶隱帶麗魚（Apistogramma bitaeniata）[37]等魚類的研究中，也得出相似的AKP 酶活性變化趨勢。水溫達到38 ℃后，試驗魚大量死亡，各品系AKP 酶活性均有下降，這與花（Hemibarbus maculatus）[38]研究結果相似；此時XY3 和HF2的AKP 酶活性顯著高于其他品系，因此，這2 個品系的高溫耐受性相對較強。

LZM 是衡量水生動物免疫狀態(tài)的一個重要指標[39]。在環(huán)境脅迫條件下，魚類通過升高溶菌酶活性做出免疫防御[40]。大西洋庸鰈（Hippoglossus hippoglossus L.）[41]、大菱鲆（Scophthalmus maximus）[42]和虹鱒（Oncorhynchus mykiss）[43]等魚類的研究均表明，溫度影響著魚體的LZM 酶活性。本試驗降溫組中，隨水溫的下降，5 個品系黑鯛肝臟LZM 酶活性均呈先上升后下降的趨勢，其均在水溫為13 ℃時最高，且差異顯著（P＜0.05），在水溫為5 ℃時最低。因此推測，低溫對幼魚機體的免疫力產生了抑制作用。史氏鱘[44]（Acipenser schrenckii）幼魚急性低溫脅迫試驗中也有類似結論。

升溫組中，隨水溫的升高，YS 的LZM 酶活性先升高后降低，水溫為30 ℃最高，但其隨水溫的升高其下降不顯著（P>0.05），其余4 個品系則均呈上升趨勢。其余各品系在水溫為38 ℃時，YS 和LZM酶活性最高，且顯著高于對照組（P＜0.05）。這與大菱鲆溫度脅迫下LZM 酶活性變化態(tài)勢相似[45]。此外，水溫為30 ℃時，YS 的LZM 酶活性達到最高值，XY3 和HF2的酶活性顯著高于XY1 和XY2。LZM 酶活性的這種變化趨勢也很好地解釋了升溫過程中，YS 最早出現大批量死亡，而XY3 及HF2存活率最高的現象。

酶活性表達與變化水平反映了5 個品系黑鯛應對溫度應激時，體內免疫水平及其器官機能狀態(tài)以及應對水溫變化的能力。HF2在升溫和降溫組中均有良好的抗逆性，這與其在養(yǎng)殖過程中的性狀優(yōu)勢表現相一致[46]。

4 結論

試驗結果顯示，在水溫為5~34 ℃時，5 個品系黑鯛存活率均>84%。T-SOD 等酶活性反映出不同品系黑鯛對水溫的上升或下降的適應水平與抗逆性存在差異，而且同一品系對高溫或低溫的酶活性變化也有不同。其中，對水溫變化的耐受能力最高的為XY3 和HF2，其次為XY1 和XY2，YS 最低。XY3 選育新品系及由雜交得到的HF2新品系面對高溫或低溫的脅迫均有較好表現。