馬尾松次生維管組織的變化特征

楊超 范付華 徐剛

關鍵詞：馬尾松；次生維管組織；結構變化；組織化學分析

植物的生長和形態具備很強的可塑性，在其生長過程中會形成新的組織，以應對季節和環境的變化。次生維管束是多年生木本植物周期性活動的產物，由維管形成層不斷分裂分化形成，其活性隨季節更替而變化。次生維管組織承擔了樹木體內物質長距離輸導的功能，內含2條主要的長距離輸導路徑：第一條為木質部，將根系吸收的水分和養分輸送到葉片，用于維持蒸騰和光合作用；第二條為韌皮部，將呼吸和生長所需的信號分子和光合產物輸送到發育組織和貯藏組織。

溫帶樹木的維管組織在春季復蘇，冬季休眠。維管組織在不同時期的形態及生理特性不同。白楊（Populus tomenosa Carr.）活躍期的維管形成層細胞壁中含有較高的甲酯化果膠和較低的酸性果膠，休眠期的維管形成層細胞壁具有較高的酸性果膠，形成層活躍期與休眠期的細胞壁結構也存在很大差異。新生管胞從維管形成層產生后經體積增大，細胞壁加厚，最終發育為成熟管胞。受維管形成層形態和季節的影響，不同時期形成的成熟管胞形態特征如直徑、長度及細胞壁厚度等存在明顯差異。管胞形態的差異直接影響了管胞的輸導能力，如冷杉（Abies fabri（Mast.）Craib）的早材輸導率約為晚材的11倍，超過90%的輸導量來自于早材。同時，樹木韌皮部與木質部的內含物及組成成分，如韌皮部的內含多糖顆粒數量、木質部纖維素、木質素、脂類提取物和碳水化合物等，其分布與含量在不同組織和活動期也有顯著差異。如云杉（Picea asperata Mast.）的心材比邊材含有更多的木質素和更少的纖維素，晚材的半乳糖、葡聚糖和甘露聚糖含量明顯高于早材，晚材的果膠含量與親脂性萃取物較早材更少。輻射松（Pir7US radiataD．Don）心材內晚材比早材含有更多的提取物，樹脂酸含量也更高。杉木（Cunninghamia lanceolata （Lamb.） Hook.）代謝產物在復蘇前后不同，丙酮酸和抗壞血酸含量在復蘇后增加，并且杉木的早材與晚材的果膠多糖、木聚糖、纖維素和木質素含量差異明顯。

馬尾松（P．massoniana Lamb.）是一種喜光、不耐蔭的速生樹種，廣泛分布于我國南方，是南方面積最大、儲量最多的針葉樹種之一。目前，有關于馬尾松維管組織的發育研究鮮有報道，細胞發育觀察也多為馬尾松產脂結構的發育研究，而馬尾松次生維管束發育、細胞結構和成分變化仍有待研究。次生維管組織是樹木的主體，承擔了物質的遠距離輸導與機械支撐功能。研究維管組織有利于深入揭示樹木的次生發育過程。本文通過組織化學分析和細胞離析等手段，研究馬尾松縱向輸導組織在不同組織的形態、結構及成分變化，旨在揭示維管組織發育過程中細胞的變化特征，為其他樹種的維管組織細胞發育研究提供借鑒與參考。

1材料與方法

1.1材料采集

采集地位于貴州省花溪區（106°39'N，26°26' E），為20世紀80年代飛播造林形成的馬尾松林。該區為亞熱帶高原季風濕潤氣候，溫潤多雨，年均氣溫15.3℃，土壤以石灰土為主，為喀斯特地貌區。在林內選取5顆胸徑30cm以上，健康的馬尾松成年樹，于2022年6月，用鑿子于馬尾松莖干1.2～1.5m處取馬尾松木質部與韌皮部材料，取樣大小為2cm×2cm×1cm，將其裁成0.5cm×2cm×1cm后放入FAA固定保存，固定時間在3d以上，用于韌皮部與木質部的細胞離析。用生長錐于莖干1.2～1.5m處鉆取木芯，要求韌皮部、形成層與木質部連接完整，隨后放人FAA固定保存，固定時間在3d以上，用于木質部細胞離析。

1.2石蠟切片觀察

將所采集木芯樣本分2組，各5個樣本，第一組將修樣后長度保留0.5～1cm，要求包含完整維管形成層及木質部；第二組修樣后保留2021年與2022年完整木質部。將修樣后的試驗材料經軟化，70%、85%、95%、100%乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟浸蠟，包埋后于石蠟切片機（Leica RM2235）切片，切片厚度12um，經展片，粘片后放人烘箱中40℃烘干備用。切片以番紅固綠染色，中性樹膠封片，顯微鏡觀察，LASX成像系統拍照。第二組樣本中每個樣本各選取3列包含完整2021年管胞的細胞列，以ImageJ統計2021年的馬尾松木質部管胞的弦向壁厚度、徑向壁厚度、弦向腔徑（弦向細胞腔直徑）、徑向腔徑（徑向細胞腔直徑）、弦向胞徑（弦向細胞直徑）和徑向胞徑（徑向細胞直徑）。同一樣本中不同細胞列的細胞層數會存在較小差異，導致不同重復的數據量不同。為便于數據統計，以細胞層數最少的細胞列為標準，將長細胞列多余數據分別在早晚材細胞列的中值周圍隨機剔除，并求取均值。

1.3細胞離析觀察

將裁好的韌皮部材料從固定液中取出，切除周皮。切片觀察結果顯示，不具輸導功能韌皮部約與木質部相距400～500um，因此，在距木質部約500um的厚度處將韌皮部切成2塊，以富蘭克林離析法分別對2塊材料進行離析，分別得到2個區域的篩胞。根據木質部的年輪，將木質部的早材和晚材分開，將早晚材轉換期管胞刮除干凈，每個樣本分別切取一部分進行混合離析，得到混合樣本的早材管胞和晚材管胞。顯微鏡觀察，DS-Fil成像系統拍照，從離析的早材和晚材管胞中隨機選取25個管胞以Image J分別統計管胞上具緣紋孔的紋孔口直徑與紋孔緣直徑。

1.4組織化學分析

2組切片經二甲苯脫蠟，無水乙醇浸泡3min， 95%乙醇浸泡3min后，放人間苯三酚染液中浸染3min，將濃鹽酸滴于切片上，可見木質素的顯色反應，同時依據酚類物質的自發熒光現象，結合熒光顯微鏡（LEICA DM3000）觀察，DS-Fil成像系統拍照。纖維素檢測選用鈣熒光白（CFW）熒光染色試劑盒（GENMED GMS 16034.1），吸取5UL GENMED染色液至離心管中，加入95UL蒸鎦水將其稀釋20倍后得到制備的染色液。將包含早晚材與維管形成層的切片經二甲苯脫蠟，梯度乙醇逐級復水后直接將染色液于暗環境下滴于切片上，室溫下靜置5min后以移液槍將染色液吸出，隨后吸取GENMED清理液（Reagent A）滴于切片上，用移液槍反復吸取混勻，5min后吸出，重復2次。最后直接置于熒光顯微鏡（LEICA DM3000）下觀察。以DS-Fil成像系統拍照，ImageJ量化第二組5張切片在早晚材相接處木質素與纖維素的組織化學顯色和熒光面積。

1.5數據處理

使用excel、SPSS和Origin 2022進行數據處理。依據數據的分布圖像，判斷管胞層與管胞各系數間為非線性關系，選用非線性模型進行擬合。通過對比origin非線性擬合函數，最后選取了擬合效果較好的Gaussmod函數對不同管胞層的細胞壁厚度、細胞直徑與細胞腔徑進行擬合。GaussMod函數：

2結果與分析

2.1馬尾松次生韌皮部的變化特征

馬尾松次生韌皮部主要由篩胞、韌皮薄壁細胞和韌皮射線組成（圖1a）。次生韌皮部在發育過程中薄壁組織增大，篩胞會被擠壓變形，失去輸導功能（圖1a）。木質素組織化學和自發熒光觀察結果顯示，不具輸導功能韌皮部出現明顯的顯色反應（圖1b），具輸導功能韌皮部與不具輸導功能韌皮部出現明顯的自發熒光差異（圖1c），說明篩胞由具輸導功能韌皮部向不具輸導功能韌皮部發育的過程中細胞壁發生了木質素沉積。為觀察篩胞的結構及不具輸導功能韌皮部內篩胞的形變情況，分別離析得到具輸導功能韌皮部和不具輸導功能韌皮部的完整篩胞，發現馬尾松篩胞壁上具篩域，篩域內具篩孔，篩胞由中間向兩端漸細（圖1d），不具輸導功能韌皮部內的篩胞形變嚴重，胞腔變小，長度低于未形變的篩胞（圖1e）。

2.2木質部管胞的形態變化

依據細胞形態將木質部劃分為早材和晚材，早材和晚材間會出現一段管胞壁逐漸增厚，胞腔逐漸縮小的轉換期（圖2a），不同樣本的管胞壁厚測量結果表明，早材的弦向壁厚及縱向壁厚大部分小于4um，而與早材相鄰的晚材管胞壁厚大部分大于4um，因此，以4um為標準劃分早材和晚材。

不同樣本的管胞壁厚度、細胞層數和早晚材細胞比例均有差異。管胞弦向壁厚和徑向壁厚隨管胞層數增加均表現為先增加后降低的變化規律（圖2b）。早材管胞的弦向壁厚度與徑向壁厚度相近，管胞徑向壁在早晚材轉換期的曲線斜率與峰值相較于弦向壁更高；到發育后期，弦向壁厚度會逐漸回落至略高于早材的壁厚水平，徑向壁厚雖有下降，但仍保持在遠高于早材管胞壁厚的水平。

不同樣本整合散點圖（圖2c）表明：馬尾松早材主要分布于25層管胞之前，早材管胞壁厚度主要分布于1.5～3um，晚材的管胞層數總體明顯高于早材管胞層數，說明成熟林1a內的晚材管胞形成量高于早材管胞形成量。

不同樣本的管胞直徑數值存在較大差異，但總體變化趨勢相似。管胞腔徑與胞徑的擬合曲線一致（圖3）表明：腔徑（d）與胞徑（D）隨管胞的發育總體呈逐漸降低的趨勢；在管胞的發育初期，腔徑與胞徑的長度表現為D徑>D弦，d輕>d弦，胞徑和腔徑變化的擬合曲線斜率相對平穩；當木質部發育進入早晚材的轉換期，胞徑與腔徑擬合曲線斜率降低，其中，kD弦>kD徑，kD弦>kd弦，kd弦>kd徑，徑向胞徑和徑向腔徑在轉換期間逐漸低于弦向胞徑和弦向腔徑；當木質部發育進入晚材期，擬合曲線的斜率再次回升至較平穩的狀態，腔徑與胞徑的長度表現為D弦>D徑，d弦>d輕。木質部1a內早晚材的弦向胞徑變化較小，變化曲線的斜率相對平穩；而早晚材的弦向腔徑、徑向胞徑和徑向腔徑的變化較大。

2.3早晚材的紋孔變化

木質部細胞離析觀察到馬尾松管胞有交叉紋孔場與具緣紋孔（圖4a、b）。在管胞的端部（圖4a）和近端部（圖4b）有大量具緣紋孔，紋孔數量從管胞兩端至管胞中段逐漸減少，管胞中段幾乎見不到具緣紋孔分布（圖4c）。

對木質部的早材和晚材分別進行了細胞離析，分別得到早材和晚材的管胞（圖4d～1）。通過對比觀察可知，早材管胞壁上附著的具緣紋孔數量明顯多于晚材部分，早材和晚材的紋孔大小也不同。比較分析（圖4m）可知：早材紋孔口與早材紋孔緣的直徑顯著大于晚材部分，表明木質部由早材發育至晚材的過程中，管胞紋孔數量減少，紋孔口直徑和紋孔緣直徑也降低。

2.4木質素和纖維素的組織化學定位

以間苯三酚對發育期的木質部進行木質素組織化學定位，可將木質部發育期的管胞劃分為3個時期，分別為徑向伸展期、次生壁增厚期和成熟期（圖5a）。管胞由維管形成層分化產生后進人徑向伸展期，初生壁發育，胞徑和胞腔持續增大。當徑向伸展期結束后初生壁停止發育，隨后管胞進人次生壁增厚期，管胞次生壁持續增厚，次生壁沉積的木質素增多；此后，管胞次生壁停止發育，進入成熟期，發育為成熟管胞。早晚材的木質素組織化學定位顯示（圖5b），晚材管胞的次生壁厚明顯高于早材，而晚材管胞的直徑明顯小于早材，晚材木質素的分布明顯多于早材。

鈣熒光白染色后的熒光結果（圖5c、d）顯示：維管形成層的熒光強度低于新生韌皮部與新生木質部，這表明維管形成層產生新生細胞后經纖維素的富集形成新的管胞與篩胞。木質部的熒光主要集中在新生管胞，韌皮部的熒光主要集中在具輸導功能區域，這是由于管胞與篩胞發生木質素沉積后使纖維素的成分占比下降，導致熒光強度降低。早晚材交界處的鈣熒光白顯色結果（圖5e）表明：早材熒光顯色較晚材更明顯；Image J量化分析結果（圖5f～h）表明：晚材木質素顯色面積占比和單位細胞顯色面積均顯著高于早材，表明晚材木質素沉積程度高于早材，而早材纖維素的單位細胞熒光面積和纖維素熒光面積與管胞壁面積的比值極顯著高于晚材，表明早材纖維素含量占比高于晚材。

3討論

樹木維管組織的季節性發育伴隨著輸導功能與機械功能的強弱變化。在韌皮部的研究中，常以篩胞形態變化劃分具輸導功能韌皮部和不具輸導功能韌皮部。本文除觀察篩胞形變特征外，還發現馬尾松篩胞發育過程中會發生木質素沉積，纖維素占比下降。木質素沉積可增強細胞壁的機械強度，篩胞失去輸導能力后機械強度增加，有利于保護韌皮薄壁組織，增加不具輸導功能韌皮部的穩定性。

細胞次生壁不僅能增強植物體機械強度，在植物生長、胞間通訊、水分運輸和機體防御等方面也發揮重要作用。本研究發現，管胞弦向壁與徑向壁厚度隨管胞層數增加表現為先大幅上升，后小幅下降的變化趨勢，表明早材向晚材變化過程中木質部的機械強度上升。同時，管胞過度加固會降低彈性模量，使水力輸導效率下降。管胞徑向壁厚度在晚材階段顯著大于弦向壁，而弦向壁厚度在晚材末期會降低至近似于早材的水平。由于相鄰管胞的紋孔成對存在，相對而生，共同構成紋孔對，晚材末期形成管胞的弦向壁厚度可能會盡量與早材相近，以形成相近的紋孔結構。裸子植物管胞直徑與腔徑決定了管胞的輸導能力。管胞的胞徑隨管胞層數變化遞減，導致胞腔逐漸減小，表明管胞的胞內輸導能力逐漸降低。

具緣紋孔是管胞間物質輸導的通道，具緣紋孔直徑越大，紋孔導度越大。本文發現，早材的紋孔數量明顯多于晚材，早材紋孔緣和紋孔口直徑也顯著大于晚材部分，表明早材的胞間輸導能力顯著高于晚材。

木質部的徑向伸展期、次生壁增厚期和成熟期是木質部研究中常用的劃分方式。本文發現，木質部的徑向伸展期發生纖維素富集，隨后在次生壁增厚期逐漸沉積木質素，并且纖維素占比下降。同時，組織染色表明，晚材木質素沉積程度顯著高于早材，纖維素的成分占比下降。Guo對油松木質部內木質素含量變化的監測結果也表明，由形成早材的活躍期向晚材為主的休眠期轉變的過程中，木質素含量持續升高。木質素含量提高還可增強樹體的抗逆性，表明管胞由早材向晚材的發育過程是次生木質部為了適應季節變化，抗逆性增強的體現。

為了揭示馬尾松次生維管組織的變化特征，本課題組繪制了馬尾松次生維管組織的變化示意圖（圖6）。維管形成層分化形成新生韌皮部和木質部時會逐漸富集纖維素。木質部管胞發育主要表現為以下幾個特征：（1）紋孔直徑降低和紋孔數量下降；（2）次生壁木質素含量增加；（3）管胞面積下降，主要通過降低細胞徑向直徑實現；（4）纖維素含量占比下降；（5）弦向壁和徑向壁增厚，但在晚材末期為適應來年早材的紋孔結構和細胞壁厚度會降低至早材水平。韌皮部的發育特征則表現為：（1）篩胞形變；（2）篩胞木質化；（3）纖維素含量占比下降。

4結論

馬尾松維管組織在其發育過程中細胞結構、成分和功能均會發生規律性變化。維管形成層分化形成新生韌皮部和木質部時會逐漸富集纖維素。木質部管胞由早材向晚材發育的過程中，其紋孔直徑降低，紋孔數量下降，次生壁木質化程度增加，胞腔面積下降，纖維素含量占比下降，弦向壁及徑向壁增厚，表明其胞間及胞內的輸導能力逐漸下降，機械強度上升，但在晚材的末期為適應來年早材的紋孔結構和細胞壁厚度會降低至早材水平。韌皮部的發育則表現為篩胞的形變、木質化與纖維素含量占比下降，表明其輸導功能喪失和機械強度上升。