β肌球蛋白重鏈基因Arg249Gln突變導致家族性肥厚型心肌病基因型與表型分析

［摘要］ 目的 篩查家族性肥厚型心肌病（HCM）致病突變基因，分析基因型與臨床表型相關性。

方法 采用全外顯子測序技術對一HCM家系先證者編碼肌節蛋白的8個致病基因進行分析，利用Sanger測序法對發現的突變位點在該家系的14名家庭成員及307名健康對照者中進行驗證。

結果 遺傳篩查發現先證者攜帶β肌球蛋白重鏈（MYH7）基因c.746G＞A（Arg249Gln）突變。家系中4人攜帶該突變，3人確診為HCM，攜帶者均有嚴重的臨床表型，2人因HCM發生猝死。在307名健康對照者中沒有檢出MYH7基因Arg249Gln突變。

結論 MYH7基因Arg249Gln突變可能是導致該家系家族性HCM的惡性突變，該突變攜帶者臨床表型較嚴重。

［關鍵詞］ 心肌病，肥厚性；猝死；肌球蛋白重鏈；突變；遺傳關聯研究

［中圖分類號］ R542.2;R394-33

［文獻標志碼］ A

［文章編號］ 2096-5532（2023）01-0038-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2023.59.021

［網絡出版］ https：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20230302.1739.008.html;2023-03-03 16：56：18

A GENOTYPE-PHENOTYPE ANALYSIS OF FAMILIAL HYPERTROPHIC CARDIOMYOPATHY CAUSED BY ARG249GLN MUTATION IN THE β-MYOSIN HEAVY CHAIN GENE

JIAO Junjie， LIU Huiting， SHAN Zhengyi， L Jialei， XIN Fangjie， ZHAO Peng

（Forensic Medicine， School of Basic Medicine， Qingdao University， Qingdao 266071， China）

; ［ABSTRACT］ "Objective "To investigate the pathogenic mutation genes for familial hypertrophic cardiomyopathy （HCM） and the association between genotypes and clinical phenotypes.

Methods "Whole-exome sequencing was used to analyze the 8 pathogenic genes encoding sarcomeric proteins in the proband of a family with HCM， and Sanger sequencing was used to validate the mutation sites in 14 family members and 307 unrelated healthy controls.

Results "Genetic screening revealed that the proband carried the c.746Ggt;A （p.Arg249Gln） mutation of the β-myosin heavy chain （MYH7） gene. Four individuals in this family carried this mutation， and three of them were diagnosed with HCM. All of the carriers had a severe clinical phenotype， and two individuals experienced sudden death due to HCM. The Arg249Gln mutation of MYH7 was not detected in 307 healthy controls.

Conclusion "The Arg249Gln mutation of MYH7 may be a malignant mutation gene leading to familial HCM， and carriers of this mutation tend to have severe clinical phenotypes.

［KEY WORDS］ "cardiomyopathy， hypertrophic; death， sudden; myosin heavy chains; mutation; genetic association studies

家族性肥厚型心肌病（HCM）是一種原發性心肌疾病，通常表現為左心室以及室間隔不規則增厚、心室腔變小，而沒有導致心臟負荷增加的其他疾病［1-2］。該病鏡下特點主要是心肌細胞排列紊亂、心肌纖維化等［3］。最新研究表明，HCM發病率已達到1/200［4］。HCM臨床表現具有明顯異質性，早期診斷該疾病一直是一個難題［5］。HCM為青年人發生心源性猝死常見的原因［6］。目前至少報道了11個基因的1 400多個突變位點與HCM相關［1］，大多都是編碼心肌肌小節蛋白基因，其中以β肌球蛋白重鏈（MYH7）基因和MYBPC3基因最常見，占50%以上［3，7-8］。其他的還有Z盤基因、鈣調節蛋白基因及HCM相關修飾基因等［9］。2014年歐洲心臟病學會制訂的HCM治療指南推薦對HCM家族進行基因檢測［10］。通過家系基因篩查，分析HCM基因型與表型相關性，對早期識別無癥狀突變者具有重要意義。本研究在一HCM家系中進行基因篩查，并與正常人群進行比較，旨在分析HCM病人基因型與表型相關性。

1 對象與方法

1.1 研究對象

一HCM家系包括先證者在內共15人（圖1），其中男性9人，女性6人，年齡18～57歲，平均年齡36歲。HCM診斷標準：經超聲心動圖檢查室間隔或左心室壁最大厚度≥13 mm，并且排除其他潛在的或存在的導致心臟負荷增加的疾病，如高血壓、心瓣膜病、先天性心臟病等［10］。以307名經心電圖和超聲心動圖檢查未見異常的健康志愿者作為對照。本研究經青島大學附屬醫院倫理委員會批準，符合《赫爾辛基宣言》原則及相關處理要求，所有參與者均簽署知情同意書。

1.2 基因組DNA提取

采集研究對象外周靜脈血4 mL，EDTA抗凝，利用血液基因組提取試劑盒（北京諾禾致源科技股份有限公司）從外周血中提取DNA，使用Qubit 3.0熒光計對DNA的濃度進行精確定量，其中含量在0.6 μg以上的DNA樣品被用來建庫。

1.3 致病基因篩查

采用全外顯子測序技術對先證者編碼肌小節蛋白的8個致病基因（MYH7、MYBPC3、TNNT2、TNNI3、MYL2、MYL3、TPM1、ACTC1）進行分析。應用Agilent的液相芯片捕獲系統，對人的全外顯子區域DNA進行高效富集（建庫和捕獲實驗均采用Agilent SureSelect Human All Exon V6試劑盒），將基因組DNA用Covaris破碎儀隨機打斷成長度為180～280 bp的片段，經末端修復和加A尾后在片段兩端分別連接上接頭制備DNA文庫。建庫后將帶有特異指標的文庫混合后與生物素標記的探針進行液相雜交，再使用帶鏈霉素的磁珠將基因上的外顯子捕獲下來。經PCR擴增后進行文庫質檢，將庫檢合格的有效數據在Illumina平臺上進行測序。獲得原始測序數據后，與人類基因組參考序列（GRCh37/hg19）進行對比，篩選出變異的基因。整個家系及健康對照者基因篩查由北京諾禾致源科技股份有限公司完成，設計MYH7基因9號外顯子上下游引物，進行PCR擴增。采用Sanger測序法對發現的可疑突變在先證者的14名家庭成員及307名健康對照者中進行驗證，并分析其臨床表型的特點。

1.4 生物信息學分析

在美國國家生物技術信息中心（NCBI）核酸數據庫中獲取人、黑猩猩、野豬、牛、褐家鼠及小家鼠等物種相應基因編碼的蛋白序列，應用Clustalx軟件分析突變氨基酸在物種間的保守性；在《ACMG遺傳變異分類標準與指南》中對比分析突變的致病性；突變在人群中發生的頻率通過檢索dbSNP（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/snp）以及1000 Genomes（http：//browser.1000genomes.org）確定；應用多種生物信息學軟件（Polyphen-2、MutationTaster以及SIFT）預測突變蛋白的致病性。

2 結" 果

2.1 基因測序

先證者攜帶MYH7基因c.746G＞A（Arg249Gln）突變，該突變位于9號外顯子上，使MYH7基因編碼的第249位氨基酸由精氨酸變為谷氨酰胺。用Sanger測序法對其家系成員及健康對照者進行該突變位點驗證，發現該家系其他成員中有3人攜帶該突變（圖2），其中2人確診為HCM，其余11名家屬及307名健康對照者均不攜帶該突變。

2.2 家系臨床表型特征

本家系中包括先證者在內4人攜帶該突變（Ⅱ-9、Ⅱ-11、Ⅲ-2、Ⅲ-11）， 3人確診為HCM（Ⅱ-9、Ⅱ-11、Ⅲ-11），1人確診為心肌致密化不全（Ⅲ-2），攜帶者均有嚴重的臨床表型，未攜帶該突變的家屬均無臨床表型。

先證者（Ⅱ-9）為57歲中年女性，34歲體檢時發現心電圖及超聲心動圖異常，確診為HCM，但無任何自覺癥狀。55歲時因呼吸困難、暈厥入院檢查。心電圖顯示：異常Q波，T波改變，QT延長；超聲心動圖顯示：室間隔厚度14 mm，左心室后壁厚度9 mm，左心室舒張末期內徑59 mm，射血分數36%（圖3）。臨床診斷：HCM（室間隔心肌肥厚）合并充血性心力衰竭，心功能Ⅲ級。

先證者妹妹（Ⅱ-11）為56歲中年女性，33歲時與姐姐一同體檢時發現超聲心動圖異常，并確診為HCM。臨床癥狀主要為反復活動后胸痛及呼吸困難，且較嚴重。56歲時心電圖顯示：ST-T改變；超聲心動圖顯示：室間隔厚度14 mm，左心室后壁厚度10 mm，左心室舒張末期內徑50 mm，射血分數為53%。先證者兒子（Ⅲ-11），35歲，32歲時確診為HCM，癥狀輕微，僅有輕度胸悶、氣短。超聲心動圖顯示：室間隔厚度17 mm，左心室后壁厚度12 mm，左心室舒張末期內徑54 mm，射血分數63%。先證者大姐（猝死）之子（Ⅲ-2），32歲，29歲時確診為心肌致密化不全，室間隔厚度10 mm，左心室后壁厚度9 mm，射血分數69%。家系中其他家庭成員均不攜帶該突變，且均無HCM相關癥狀，心電圖及超聲心動圖也無異常。

2.3 MYH7基因Arg249Gln突變生物信息學分析

應用Clustalx軟件對該突變的物種間保守性進行分析發現，MYH7基因編碼的第249位氨基酸為高度保守區域（圖4），此位點位于肌球蛋白頭部與ATP結合部位附近，該區域高度保守，有重要的功能，該區域氨基酸改變可能會影響蛋白的功能。在《ACMG遺傳變異分類標準與指南》中進行對比分析，確定該突變為致病突變（PS4+PM1+PM2+PP1+PP3）。該突變在dbSNP以及1000 Genomes數據庫中均顯示與HCM相關。應用Polyphen-2、Mutation Taster、SIFT等生物信息學軟件預測該突變蛋白的致病性，3種軟件預測結果一致（表1），說明MYH7基因Arg249Gln突變為有害突變。

3 討" 論

粗肌絲由肌球蛋白和肌球蛋白結合蛋白C構成。肌球蛋白是一種由6條多肽鏈組成的桿狀分子，包含2條重鏈和4條輕鏈，整個分子可分為頭部、頸部和桿部，頭部在肌絲滑動中的主要作用是結合肌動蛋白、結合和分解ATP［9，11-12］。MYH7基因編碼蛋白是心肌肌球蛋白的重要組成成分，現已證實MYH7基因發生突變會導致HCM［13］。MYH7基因位于染色體14q11-12，長度為23 kb，編碼1 935個氨基酸，共包括40個外顯子，3～21號外顯子構成其頭部，21～25號外顯子構成其頸部，25～40號外顯子構成其桿部，突變位置并不是隨機的，大部分突變聚集于頭頸部，桿部突變較為少見［14］。目前關于MYH7基因報道的突變大部分為錯義突變［15］。HCM的發病機制主要有單倍型不足、突變蛋白（毒肽）形成和能量代謝異常。現在越來越多的人認為，性別是影響HCM病人臨床表型的重要因素。與冠心病一樣，與女性相關的內分泌特征可能會延遲HCM表型和臨床表現的發展，雌激素對繼發性心肌肥厚的發展具有抑制作用［16］。CHANG等［17］對比了正常人和HCM致病基因（MYBPC3、MYH7、TNNT2、TNNI3）突變病人心肌細胞中的端粒的大小，發現HCM病人心肌細胞中端粒明顯較短。MYH7基因Arg249Gln突變位于肌球蛋白頭部9號外顯子上與ATP結合部位附近，該區域高度保守［18］。該突變可能影響橫橋與ATP結合并影響ATP酶的活性，而長期能量代謝異常會導致HCM發生［19］。所以糾正異常的能量代謝，可能可以改善HCM病人的臨床表型及預后，相關臨床研究正在進行中［20］。

本研究中檢出的MYH7 c.746G＞A（Arg249Gln）突變在1991年首次被描述［21］，此后在ClinVar數據庫和文獻中多次被報道。WATKINS等［22］的Kaplan-Meier曲線研究和LOPORCARO等［23］的病例報道都表明，攜帶該基因突變的人可能在青少年時期就突然死亡。ARBUSTINI等［24］報道了一HCM合并充血性心力衰竭家系，發現Arg249Gln突變與mtDNA突變共存，認為Arg249Gln突變是HCM表型真正的決定因素，而mtDNA突變影響能量供應，進而導致充血性心力衰竭。NAG等［25］認為，Arg249Gln突變削弱了S1與S2的結合，從而影響肌球蛋白功能。發生在這一部位附近的突變位點有Arg243His、Gly256Glu和Phe244Leu等，它們均對核苷酸結合位點產生不良后果。本研究中攜帶Arg249Gln突變的先證者呼吸困難、暈厥嚴重；物種間保守性分析結果提示該突變氨基酸殘基在不同物種間高度保守，其翻譯產生的蛋白功能可能會存在異常，對機體造成不利影響，而正常人群中不存在該突變；多種生物信息學軟件評價結果一致，均認為該突變對蛋白影響較大。結合臨床表型，推測此突變可能引起HCM，故建議病人定期檢查，預防猝死發生。該家系中有5人已經去世，分別為先證者父親（Ⅰ-1）、母親（Ⅰ-2）、大姐（Ⅱ-2）、三姐（Ⅱ-6）、四姐（Ⅱ-8），其中先證者父親和母親因去世無法進行基因檢測，但通過孟德爾遺傳規律可推測二者其一攜帶該突變。另外，先證者大姐、三姐因HCM發生猝死，推測她們也攜帶該突變。先證者三姐的女兒（Ⅲ-7）沒有進行基因檢測，雖超聲心動圖正常，也無自覺癥狀，但尚不能確定她是否攜帶該突變。先證者外甥診斷為心肌致密化不全，該病與MYH7基因Arg249Gln突變的關系還有待于進一步研究。

本家系參與基因篩查者共15人，有4人攜帶突變，3人確診為HCM，外顯率為75%，發病年齡在30～35歲，有2人因HCM發生心源性猝死。該家系存在心臟不良事件，提示該突變引起的HCM心肌肥厚程度嚴重、預后差，故認為該突變為惡性突變，這與有關的研究結果相一致［22-23］。HCM最嚴重的并發癥即心源性猝死，多見于青年人，在老年HCM病人中，以心房顫動和心力衰竭更常見［26］。先證者充血性心力衰竭較為嚴重，但因未檢測其mtDNA是否存在突變，故無法驗證Arg249Gln突變是否與mtDNA突變共存為本研究不足之處。

綜上所述，本研究對一HCM家系中的15名成員進行基因篩查，檢出MYH7基因c.746G＞A （Arg249Gln）突變。該家系中曾發生過心臟不良事件，且攜帶者臨床表型嚴重，推測該突變為該HCM家系的惡性基因突變，可能引起HCM。除先證者需要基因篩查外，無癥狀家庭成員也需要進行基因篩查。無癥狀者基因篩查的好處是，可以準確識別無癥狀致病基因攜帶者，從而達到早期診斷和早期干預的目的，而非攜帶者可以免于進一步的心電圖和超聲心動圖檢查，從而節省大量費用，也可減少他們對不良結果的擔憂。所以對家族性HCM家庭成員進行該突變位點篩查，對HCM的早期診斷及早期干預治療具有重要臨床意義，進而可以減少心臟不良事件的發生。

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（本文編輯 馬偉平）