LATS2 對惡性周圍神經鞘瘤細胞的調控作用及分子機制探討

趙洋，孫亞敏，朱香熹，陳毓鍇，朱澤

（1.天津醫科大學基礎醫學院病原生物學系，天津 300070；2.遵義醫科大學珠海校區臨床醫學系，珠海 519090；3.天津醫科大學南開臨床學院，天津 300102）

惡性周圍神經鞘瘤（malignant peripheral nerve sheath tumor，MPNST）是一種侵襲性的高度惡性軟組織肉瘤，起源于施萬細胞或施萬前體細胞[1]，約占軟組織肉瘤的5%～10%，易早期轉移，由于對放化療有耐藥性而預后較差、死亡率較高。近年來，隨著對表觀遺傳學的深入了解，越來越多的研究關注于推動癌癥進展的表觀遺傳機制。多梳抑制復合物2（polycomb repressive complex，PRC2）核心組分由Zeste12 抑制因子（suppressor of zeste 12，SUZ12）、Zeste 基因增強子同源物2（enhancer of zeste homolog 2，EZH2）和負責變構激活的胚胎外胚層發育基因（embryonic ectoderm development，EED）組成，作為重要的表觀遺傳修飾酶，已被證明在MPNST中存在多組分的缺失，不能催化組蛋白3 第27 位賴氨酸上的三甲基化（trimethylation of lysine 27 on histone3，H3K27me3）形成，解除對基因沉默的維持作用，驅動良性前體腫瘤惡性轉化為MPNST[2]。本課題組前期研究也顯示，SUZ12 和H3K27me3 在42 例國內MPNST 臨床組織樣本也存在缺失現象，并明確了SUZ12 缺失的意義[3]。

在HIPPO 信號通路的經典途徑中大腫瘤抑制激酶1/2（large tumor suppressor kinase 1/2，LATS1/2）磷酸化下游效應因子Yes 相關蛋白（Yes-associated protein，YAP）和含有PDZ 結合位點的轉錄共激活因子（transcription coactivator with PDZ-binding motif，TAZ），使其發生胞漿滯留，不能入核執行轉錄激活作用，從而調控組織器官的體積及大小[4]。一項研究采用免疫組化的方法在45 例MPNST 組織標本中驗證了YAP 和TAZ 的核表達陽性率，分別是58%和72%[5]，表明YAP 和TAZ 在MPNST 中呈過度激活狀態，然而，HIPPO 通路中很少發生突變，其信號的失調很可能是由于上游基因的表觀遺傳改變等異常引起[6]。相關研究報道顯示，在Schwann 細胞中敲除LATS1/2 會導致YAP/TAZ 的過度激活，并形成MPNST 樣腫瘤[7]。此外，研究發現LATS2在Hela-S3 細胞中正向調控PRC2 組分的蛋白和轉錄水平，以維持H3K27me3 的完整性[8]，表明LATS2在維持表觀遺傳完整性方面具有一定的作用。因此，課題組前期對MPNST 細胞系進行了RNA-seq，發現LATS2 存在缺失現象，為驗證其缺失是否參與調控MPNST 惡性進展，本研究通過在MPNST 細胞系中過表達LATS2 探討其對PRC2 組分的表達是否存在調控作用，并探索LATS2 對MPNST 細胞系增殖、遷移的影響及機制，為臨床治療提供新的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料和儀器 STS26T、ST88-14 細胞株由天津醫科大學腫瘤醫院楊吉龍教授饋贈；過表達慢病毒購 自 上 海 吉 凱 公 司；LATS2、YAP、TAZ、SUZ12、EZH2、EED 引物由浙江金唯智公司合成；CCK-8 試劑盒購自新賽美公司；TAZ 抗體購自Proteintech 公司；p-TAZ 抗 體 購 自CST 公 司；LATS2、YAP、p-YAP、SUZ12、EZH2、EED、H3K27me3 抗體購自Abcam 公司；BIRC5、CTGF 抗體購自Wanleibio 公司；熒光定量PCR 儀購自Applied Biosyst 公司；電泳儀和凝膠成像分析儀購自BIORAD 公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 人MPNST 細胞系STS26T、ST88-14 采用含10% 胎牛血清和1% 青/鏈霉素的DMEM完全培養基，于37℃、7.5%CO2孵箱培養。

1.2.2 慢病毒感染人MPNST 細胞系STS26T、ST88-14 實驗分為陰性對照（LV-VETOR）組、過表達LATS2（LV-LATS2）組。對數生長期的細胞接種于6孔板，保證第2 天細胞密度為20%～30%。根據細胞最適MOI（MOI=50）及細胞數、病毒滴度計算需加入病毒量。病毒于冰上融化，細胞換液并預留加入病毒液體積，分別加入病毒及感染增強液。37℃培養16 h 后更換為正常培養基，繼續培養至72 h后熒光顯微鏡觀察感染效率，細胞綠色熒光率＞80%用于后續實驗。

1.2.3 CCK-8 實驗 感染后處于對數生長期的細胞消化并計數，調整為細胞密度3×104個/mL 的細胞懸液，取100 μL 細胞懸液接種于4 塊96 孔板，設3 個復孔。分別培養24、48、72、96 h，棄液并加入110 μL 含10 μL CCK-8 試劑的無血清培養基。37℃孵育2 h 后使用酶標儀測定450 nm 處吸光度值。

1.2.4 劃痕實驗 6孔板底部劃線，每孔均勻穿過5 條直線，觀察點為直線與劃痕的交叉點。感染后處于對數生長期的細胞消化并計數，每組取7×105個細胞接種于6 孔板，過夜培養。用200 μL 槍頭垂直底部橫線豎向劃痕，PBS 清洗3 次后加入含1%FBS 的DMEM 培養基，繼續培養。觀察并拍照記錄0、48 h 細胞遷移情況。

1.2.5 免疫印跡實驗 慢病毒感染細胞至72 h 時，加入RIPA 裂解液提取總蛋白，取上清進行BCA 蛋白定量測定蛋白濃度，金屬浴中加熱10 min，保存于-20℃。蛋白上樣量20 μg，經SDS-PAGE 電泳分離蛋白，轉膜條件為300 mA 恒流，80 min，封閉2 h。一抗：LATS2（1∶1 000）、YAP（1∶1 000）、p-YAP（1∶1 000）、TAZ（1∶1 000）、p-TAZ（1 ∶1 000）、BIRC5（1 ∶500）、CTGF（1 ∶500）、SUZ12（1∶1 000）、EZH2（1∶1 000）、EED（1∶1 000）、H3K27me3（1∶1 000）、GAPDH（1∶3 000）、β-actin（1∶3 000）。4℃孵育過夜，室溫二抗孵育1 h，顯影并曝光。

1.2.6 實時熒光定量RT-PCR 慢病毒感染細胞至48 h 時，用Trizol 裂解法提取細胞總RNA，紫外分光光度計測定RNA 濃度，并逆轉為cDNA，以此為模板進行熒光定量RT-PCR 檢測。引物序列表1。

表1 LATS2、YAP1、TAZ、BIRC5、CTGF、SUZ12、EZH2、EED 引物序列Tab 1 Primer sequences of LATS2，YAP1，TAZ，BIRC5，CTGF，SUZ12，EZH2 and EED

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism 8.0 和Image J 軟件進行數據分析和作圖。數據符合正態分布，采用t 檢驗進行差異分析，P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 慢病毒介導的LATS2過表達效果檢測 慢病毒感染人MPNST 細胞系ST88-14、STS26T 72 h 熒光感染效率（圖1A）；實時熒光定量RT-PCR 結果顯示，與LV-VETOR 組相比，LV-LATS2 組ST88-14、STS26T 細胞LATS2 mRNA 表達水平明顯升高（t=9.516、16.75，均P＜0.001，圖1B）；Western 印跡結果顯示，與LV-VETOR 組相比，LV-LATS2 組ST88-14、STS26T 細胞LATS2 蛋白表達水平明顯升高（t=13.58、10.86，均P＜0.001，圖1C）。

圖1 慢病毒介導的LATS2 過表達效果檢測Fig 1 Detection of the effect of lentiviral-mediated LATS2 overexpression

2.2 過表達LATS2顯著抑制人MPNST細胞系的 增殖能力CCK-8實驗結果顯示，與LV-VETOR組相比，LV-LATS2 組ST88-14、STS26T 細胞48、72、96 h OD 值均顯著降 低（t=4.219、14.66、11.5，均P＜0.05；t=5.674、7.118、10.77，均P＜0.01）（圖2）。

圖2 過表達LATS2 對人MPNST 細胞系增殖的影響Fig 2 Effect of LATS2 overexpression on the proliferative of human MPNST cell lines

2.3 過表達LATS2 顯著抑制人MPNST細胞系的遷移能力 劃痕實驗結果顯示，與LV-VETOR 組相比，LV-LATS2 組ST88-14 細胞遷移率降低23.6%（t=4.838，P＜0.01），STS26T 細胞遷移率降低12.5 %（t=4.736，P＜0.01）（圖3）。

圖3 過表達LATS2 對人MPNST 細胞系遷移的影響Fig 3 Effect of LATS2 overexpression on the migration of human MPNST cell lines

2.4 過表達LATS2 升高YAP/TAZ 蛋白的磷酸化水平，從而影響下游基因表達 實時熒光定量RT-PCR結果顯示，與LV-VETOR 組相比，LV-LATS2 組ST88-14 細胞、STS26T 細胞的YAP、TAZ mRNA 表達水平差異均無顯著統計學意義（t=0.655 2、2.266，均P＞0.05；t=1.500、2.489，均P＞0.05），BIRC5、CTGF mRNA 表達水平均顯著降低（t=10.65、7.349，均P＜0.01；t=14.73、15.11，均P＜0.0 01）（圖4A）；Western 印跡結果顯示，與LV-VETOR 組相比，LVLATS2 組ST88-14 細胞、STS26T 細胞YAP、TAZ 總蛋白表達水平均無顯著統計學差異（t=0.778 2、0.020 1，均P＞0.05；t=0.018 18、1.030，均P＞0.05），磷酸化水平均顯著升高（t=6.233、3.759，均P＜0.01；t=3.440、2.947，均P＜0.05），BIRC5、CTGF 蛋白表達水平均顯著降低（t=5.134、5.138，均P＜0.01；t=5.676、8.205，均P＜0.01）（圖4B）。

圖4 過表達LATS2 對人MPNST 細胞系YAP/TAZ 磷酸化水平的影響Fig 4 Effect of LATS2 overexpression on YAP/TAZ expression levels in human MPNST cell lines

2.5 過表達LATS2 對PRC2 核心組分轉錄及蛋白水平無顯著影響但升高H3K27me3 蛋白水平 實時熒光定量RT-PCR 結果顯示，與LV-VETOR 組相比，LV-LATS2 組ST88-14、STS26T 細胞中SUZ12、EZH2、EED mRNA 表達水平均無顯著統計學差異（t=1.465、2.149、1.202，均P＞0.05；t=0.328 8、0.875 8、1.982，均P＞0.05）（圖5A）；Western 印跡結果顯示，與LV-VETOR 組 相 比，LV-LATS2 組ST88-14、STS26T 細胞SUZ12、EZH2、EED 蛋白表達水平均無顯著統計學差異（t=1.262、1.196、0.3120，均P＞0.05；t=0.264 3、0.340 3、0.579 7，均P ＞0.05），H3K27me3表達水平明顯升高（t=6.569、16.68，均P＜0.01）（圖5B）。

圖5 過表達LATS2 對人MPNST 細胞系PRC2 組分表達水平的影響Fig 5 Effect of LATS2 overexpression on the expression level of PRC2 components in human MPNST cell lines

3 討論

MPNST 由于其基因層面的異質性，診斷治療方法的局限性以及高度侵襲性，使其在臨床上一直屬于難治性腫瘤，可分為NF1 相關型、散發型及放化療相關型，分別占50%、40%、10%，其中NF1 相關型MPNST 被證明預后最差[9]。Ⅰ型神經纖維瘤病（neurofibromatosis type 1，NF-1）是一種常染色體顯性遺傳病，發病率為1/3 000，由NF1 基因缺失突變引起，患者發展為MPNST 的風險是普通人群的1 000 倍[10]。大量研究表明，NF1 基因的缺失僅引起良性病變，惡性轉化的發生依賴于額外的遺傳變異，尤其是表觀遺傳機制的異常，包括PRC2 核心組分缺失引起的H3K27me3 表達水平異常[11]。目前臨床上仍然缺乏有效治療藥物，嚴峻的現實急需對促進MPNST 發生、發展的機制進行新的探索，以尋找新的治療靶點。

LATS2 定位于染色體13q11-12，編碼Ser/Thr激酶，參與多種生物學過程，包括細胞周期G1/S 轉換[12]、有絲分裂[13]、DNA 損傷[14]等。LATS2 在腫瘤惡性進展中的作用和機制十分復雜，其通過HIPPO 經典途徑MST1/2-LATS21/2-YAP/TAZ 軸抑制腫瘤進展的相關研究已被大量文獻報道，如Guo 等[15]，Shi等[16]的研究指出LATS2 在膠質瘤中通過滅活YAP抑制膠質瘤細胞的惡性行為。另外，LATS2 可通過直接抑制MDM2 的活性促進P53 的穩定性[17]，且通過P53 依賴性機制下調Bcl 家族的抗凋亡蛋白發揮誘導凋亡的作用[18]，從而抑制腫瘤發生、發展。最近，有研究發現在Hela-S3 細胞中LATS2 可與染色質上的PRC2 結合并使其磷酸化，影響PRC2 的HMTase能力，以激酶依賴的方式調控H3K27me3 表達，同時可正向調控PRC2 組分的蛋白及轉錄水平[4]。本課題組前期研究顯示，在42 例國內MPNST 臨床組織樣本中存在SUZ12 和H3K27me3 缺失現象[3]，因此，提出LATS2 參與調控MPNST 表觀遺傳機制的假設。

課題組前期對MPNST 細胞系ST88-14 及STS26T 進行了RNA-seq，發現LATS2 均存在缺失現象，因此本研究旨在闡明LATS2 對MPNST 細胞系H3K27me3 表達的影響，探討其與PRC2 核心組分之間的相互作用關系，驗證LATS2 對細胞增殖、遷移的影響及機制。研究結果顯示，過表達LATS2 一定程度上抑制MPNST 細胞系的增殖和遷移。數據顯示，ST88-14 和STS26T 細胞中過表達LATS2 明顯提高YAP/TAZ 的蛋白磷酸化水平，并降低下游效應因子BIRC5、CTGF 的表達，這一發現證實了LATS2 在MPNST 中通過調控YAP/TAZ 的磷酸化水平發揮抑癌作用。而且，過表達LATS2 明顯提高H3K27me3 蛋白水平，表明在MPNST 細胞系中LATS2 具有參與協調表觀基因組的作用。Wu 等[7]報道，在Schwann 細胞系中敲除HIPPO 通路的LATS1和LATS2 會產生組織學上與MPNST 相似的腫瘤。Inoue 等[19]建立了LATS 驅動的GEM-MPNST 模型和NF1/P53 驅動的GEM-MPNST 模型，并進行了轉錄本的比較，發現兩種腫瘤均缺乏LATS1/2 蛋白，并且含有高水平的TAZ 蛋白，且均顯示出不同程度的H3K27me3 丟失，這與筆者的結果相一致。值得注意的是，過表達LATS2 并未對PRC2 核心組分SUZ12、EZH2、EED 的mRNA 和蛋白水平產生影響。據報道，在爆發性肝功能衰竭中lncRNA NEAT1可向LATS2 啟動子區招募EZH2，EZH2 通過促進H3K27me3 形成抑制LATS2 的表達[20]，而且在MPNST 中EZH2 已被證明未發生突變，相比于SUZ12、EED 缺失現象，一些MPNST 中表現出EZH2 的過度表達[21]，這可能解釋了過表達LATS2 后ST88-14及STS26T 中H3K27me3 升高的現象，并提示EZH2在MPNST 發病機制中的潛在作用，這一假設還需進一步實驗驗證。另外，一項研究采用CRISPR Cas9技術在人類永生化Schwann 細胞模型和人類MPNST 細胞系中，分別誘導103 個腫瘤抑制基因（TSG）和癌基因候選基因的功能缺失突變，其中TAOK1、GDI2、NF1 和APC 基因中的功能缺失突變導致永生化人Schwann 雪旺細胞的轉化和異種移植模型中的腫瘤形成，且導致HIPPO/YAP 信號的激活，這可能是MPNST 中YAP/TAZ 過度激活的又一誘因，有望為揭示MPNST 發病機制開啟新的方向[22]。

綜上所述，本研究證實了LATS2 過表達后可升高H3K27me3 表達水平，并通過改變YAP/TAZ 的磷酸化水平，降低下游基因BIRC5、CTGF 表達，從兩個方面調控MPNST 細胞系的增殖和遷移，闡明了LATS2 在MPNST 細胞系中參與調控表觀遺傳，其低表達是促MPNST 惡性進展的重要因素，有助于為臨床抗腫瘤治療提供新的靶點和理論參考。