hnRNPU 過表達抑制PIM1 誘導的細胞衰老的機制研究

肖雅雯，陽檢明

（天津醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院免疫學系，天津 300070）

原癌基因誘導的衰老發(fā)生在腫瘤形成的早期，能夠限制癌基因突變所導致的細胞增殖，使腫瘤維持在非侵襲性的癌前病變狀態(tài)，被認為是一種腫瘤抑制機制。原癌基因人前病毒整合位點1（proviral integration site 1，PIM1）最早是作為小鼠白血病病毒的前病毒插入點而被發(fā)現(xiàn)的[1]，它能編碼一個組成激活型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶。PIM1 通過磷酸化多種底物起到調(diào)節(jié)細胞增殖、生存、分化、凋亡和耐藥的作用[2-3]。有研究表明，在衰老細胞中，PIM1的表達顯著升高，衰老細胞中白細胞介素（IL）-6/信號轉(zhuǎn)導與轉(zhuǎn)錄因子3（STAT3）通路能夠直接上調(diào)PIM1的表達[4]。PIM1 誘導的細胞衰老限制了PIM1 在非腫瘤細胞中的原癌基因特性，但當細胞繞過衰老程序后，PIM1 又呈現(xiàn)出促腫瘤的特性。雖然筆者前期文章發(fā)現(xiàn)UHRF1 的下調(diào)是PIM1 誘導細胞衰老的一個重要機制，但是過表達UHRF1 并不能完全拯救PIM1 誘導的細胞衰老，表明PIM1 誘導細胞衰老存在其他機制[4-5]。

核異質(zhì)核糖核蛋白U（heterogeneous nuclear rib onucleoprotein U，hnRNPU）又名腳手架附著因子A，是hnRNPs 蛋白成員之一。hnRNPU 與許多水平的基因調(diào)控有關(guān)，包括維持核內(nèi)染色體構(gòu)象、轉(zhuǎn)錄、RNA 剪接和DNA 修復等。hnRNPU 通常在胎兒大腦、成人心臟、腎臟、肝臟、大腦和小腦中表達，主要與活性染色質(zhì)結(jié)合，在有絲分裂中發(fā)揮著重要作用。hnRNPU 蛋白能夠促進穩(wěn)健的DNA 復制來確保持續(xù)的細胞增殖，hnRNPU 磷酸化和去磷酸化的任何異常都可能導致不正常的有絲分裂從而致病[6-7]。hnRNPs 的家族成員也在RNA 的增強或剪接抑制以及在生理和病理生理條件下維持細胞穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮著關(guān)鍵作用[8-9]。最近的多項研究都證實其能夠影響腫瘤或神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生、發(fā)展[10-11]，可能具有成為相關(guān)疾病的治療靶點。有研究證明，hnRNPU 能夠與長非編碼核糖核酸PANDA 相互作用，在細胞進入和退出衰老過程中起到關(guān)鍵作用[12]。本研究發(fā)現(xiàn)hnRNPU 過表達抑制PIM1 誘導的細胞衰老，進一步闡釋了PIM1 誘導細胞衰老的分子機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細胞及細胞培養(yǎng) 人胚肺成纖維細胞2BS細胞和人胚腎細胞293T 細胞均購自中國典型培養(yǎng)物保藏中心細胞庫。2BS 和293T 細胞復蘇后，用含有10%FBS 的DMEM 培養(yǎng)基在37℃恒溫，5%CO2培養(yǎng)箱里培養(yǎng)，48 h 傳代1 次。

1.1.2 試劑及試劑盒 FBS 胎牛血清和DMEM 培養(yǎng)基購自Gibco 公司；0.25%的胰蛋白酶購自凱基生物公司；Trizol 試劑購自Invitrogen 公司；HiFiScript cDNA Synthesis Kit 和ultraSYBR Mixture 試劑購自北京康為世紀公司；羅氏無EDTA 蛋白酶抑制劑購自瑞士羅氏公司；RIPA 裂解液、RNA 提取試劑盒和衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑VigoFect 購自維格拉斯生物技術(shù)（北京）公司；銀染試劑盒購自Thermo 公司；β-Actin 抗體購自Sigma-Aldrich 公司；p53、p21和p16 抗體購自Santa 公司；hnRNPU 抗體購自Abcam 公司。

1.2 方法

1.2.1 質(zhì)粒構(gòu)建 構(gòu)建PIM1 過表達質(zhì)粒pITAPIM1 和hnNRPU 過表達質(zhì)粒pITA-hnNRPU，對照質(zhì)粒為pITA 空載。構(gòu)建質(zhì)粒的引物見表1。

表1 引物序列Tab 1 Primer sequences

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染及病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)2BS細胞 293T 細胞生長密度達40%～60%時，轉(zhuǎn)染前1 h，更換新鮮培養(yǎng)基，取20 μg DNA［（psPAX2：pMD2G：pITA）或者（psPAX2：pMD2G：pITA-PIM1=4∶3∶2）或者（psPAX2：pMD2G：pITA-hnNRPU=4∶3∶2）］加入空白培養(yǎng)基稀釋至500 μL，取10 μL VigoFect 加入空白培養(yǎng)基稀釋至500 μL，室溫放置5 min。將稀釋好的DNA 逐滴加入至稀釋后的VigoFect，混勻，室溫放置15 min，逐滴加入至293T 細胞中培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染48 h 和72 h 后，取培養(yǎng)上清感染2BS 細胞，48 h 后用嘌呤霉素篩選。

1.2.3 細胞分組 按上述病毒穩(wěn)轉(zhuǎn)2BS 細胞后，將細胞分為空載對照組（轉(zhuǎn)入空載對照的2BS 細胞組）、PIM1 組（過表達PIM1 的2BS 細胞組）和PIM1+hn-RNPU 組（同時過表達hnRNPU 和PIM1 的2BS 細胞組）。

1.2.4 Western 印跡檢測衰老相關(guān)蛋白p53、p21 和p16 以及hnRNPU 表達水平 相應的細胞經(jīng)預冷的PBS 洗3 遍后，加入含蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解液，冰上裂解30 min，將細胞轉(zhuǎn)移至EP 管中，4℃，14 000 r/min，離心20 min 后取10 μL 上清按照BCA 試劑盒說明書進行蛋白定量；剩余的上清加入5×loading buffer，混勻，99℃金屬浴，10 min，各組取30 μg 蛋白經(jīng)10%SDS-PAGE 電泳（壓縮膠70 V，分離膠110 V），使目的蛋白充分分離，結(jié)束電泳，將其轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上（濕轉(zhuǎn)法，恒壓110 V，70 min），用5%BSA 或者脫脂牛奶封閉1 h 后，孵育相應的一抗（稀釋比例均為1∶1 000），4℃過夜，用TBST 洗滌3 次，每次15 min，室溫孵育相應的二抗（稀釋比例均為1∶10 000）1 h，用TBST 洗滌3 次，每次10 min，進行化學發(fā)光成像。

1.2.5 衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色實驗檢測細胞衰老水平 將1×104相應的細胞提前24 h 接種至6孔板中，用PBS 洗滌1 次，加入固定液，室溫固定15 min，棄掉固定液后按照試劑盒說明書進行染色，在光學顯微鏡下拍照，衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色陽性細胞即為衰老細胞，每孔至少拍取5 個隨機視野進行統(tǒng)計。

1.2.6 免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜分析實驗檢測PIM1有效免疫沉淀hnRNPU蛋白 PIM1組和空載Control 組細胞經(jīng)預冷的PBS 洗3 遍后，每10 cm 細胞培養(yǎng)皿中加入1 mL 含蛋白酶和磷酸酶抑制劑的裂解液，用細胞刮將細胞刮下轉(zhuǎn)移至EP 管中，4℃裂解30 min；4℃，14 000 r/min，離心20 min 后取上清，加入2 μg PIM1 抗體和30 μL G-Sepharose 珠子進行免疫沉淀，4℃孵育過夜；用1 mL 洗滌緩沖液清洗5 次，加入30 μL 5×loading，99℃，金屬浴10 min；4℃，500 g 離心5 min 后各組取30 μL 進行10%SDS-PAGE 電泳（壓縮膠70 V，分離膠110 V），并按照銀染試劑盒說明書進行銀染，將差異條帶送至公司進行質(zhì)譜分析。

1.2.7 Real-time PCR 實驗檢測hnRNPU mRNA 表達水平 提前24 h 將PIM1 組和空載Control 組細胞鋪至6 孔板中，待細胞密度生長至80%～90%，加入1 mL Trizol，裂解5 min，按照試劑盒提取總RNA并用Nanodrop 2000 分光光度計檢測總RNA 濃度，取1 μg RNA 逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，進行實時熒光定量PCR。20 μL 反應總體系，包含10 μmol 上游引物，10 μmol 下游引物，UltraSYBR Mixture，40 ng cDNA模板，ddH2O 補齊至20 μL；使用Light Cycler 96 Real-Time PCR System 進行檢測，PCR 程序為：95℃5 min，40 個循環(huán)（95℃孵育20 s，60℃孵育20 s，72℃孵育20 s），95 ℃延 伸5 min；數(shù) 據(jù) 用2-ΔΔCT公式計算，以內(nèi)源性管家基因β-actin 為內(nèi)參。PT-qPCR 所用引物如表2。

表2 PCR 擴增目的片段引物序列Tab 2 Primer sequences of PCR amplification target fragments

1.3 統(tǒng)計學處理 應用Prism 軟件進行數(shù)據(jù)分析，所有實驗都重復3 次，數(shù)據(jù)以x±s 表示。多組間相互比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用t 檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 PIM1 過表達促進細胞衰老 Western 印跡實驗結(jié)果顯示，與空載對照組相比，PIM1 組細胞衰老相關(guān)蛋白p53、p21 和p16 的表達量顯著上調(diào)（圖1A，p53，t=4.360，P＜0.05；p21，t=3.814，P＜0.05；p16，t=4.720，P＜0.01）。衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色實驗結(jié)果顯示，與空載對照組相比，PIM1 組衰老細胞增加（圖1B，t=6.831，P＜0.01）。

圖1 PIM1 過表達促進細胞衰老Fig 1 PIM1 overexpression promoted cellular senescence

2.2 PIM1 能有效免疫沉淀hnRNPU 蛋白 免疫沉淀實驗結(jié)果顯示，與空載Control 組相比，PIM1 組在分子量100 kD 的位置存在差異條帶（圖2A）。將差異條帶進行質(zhì)譜鑒定，結(jié)果顯示，免疫沉淀物檢測到hnRNPU（圖2B）。

圖2 PIM1 能有效免疫沉淀hnRNPUFig 2 PIM1 effectively immunoprecipitated hnRNPU

2.3 PIM1 過表達下調(diào)hnRNPU 蛋白表達 Realtime PCR 實驗結(jié)果如圖3A 所示，與空載對照組相比，PIM1 組hnRNPUmRNA 水平不發(fā)生變化（圖3A，t=0.295，P=0.783）。Western 印跡實驗結(jié)果如圖3B 所示，與空載對照組相比，PIM1 組hnRNPU 蛋白水平顯著下降（圖3B，t=33.85，P＜0.001）。

圖3 PIM1 過表達下調(diào)hnRNPU 表達Fig 3 PIM1 overexpression down-regulated hnRNPU expression

2.4 過表達hnRNPU抑制PIM1誘導的細胞衰老 與PIM1組相比，PIM1+hnRNPU 組衰老相關(guān)蛋白p53、p21 和p16 的表達均明顯下降（圖4A，p53，t =15.317，P＜0.001；p21，t =8.012，P＜0.01；p16，t=14.080，P＜0.001）。衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色實驗結(jié)果如圖4B 所示，與PIM1 組相比，PIM1+hnRNPU 組衰老細胞減少（圖4B，t=10.38，P＜0.01）。

圖4 過表達hnRNPU 抑制PIM1 誘導的細胞衰老Fig 4 Overexpression of hnRNPU inhibited cellular senescence induced by PIM1

3 討論

細胞衰老是指細胞脫離細胞周期并不可逆地喪失增殖能力后進入的一種相對穩(wěn)定的狀態(tài)。已有研究表明，遺傳因素、DNA 損傷、端粒功能異常和癌基因的激活等多種內(nèi)外刺激都能誘導細胞衰老[13]。衰老細胞的最基本特征是衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶的表達增加。目前已知與細胞衰老相關(guān)的信號通路主要有p16-Rb 通路和p53-p21 通路，其中p21 和p16 是誘導細胞衰老和細胞周期停滯的腫瘤抑制因子[14-15]。細胞衰老可阻止致癌基因激活、遺傳不穩(wěn)定和受損細胞的增殖，是一種重要的腫瘤抑制機制[16]。此外，原癌基因的激活是腫瘤發(fā)生、發(fā)展的一個關(guān)鍵因素。盡管原癌基因的激活可以刺激細胞增殖，然而原癌基因的激活可誘導細胞發(fā)生衰老[17]。原癌基因誘導的細胞衰老使腫瘤停滯在癌前病變的狀態(tài)，是一種潛在的腫瘤抑制機制。因此，揭示原癌基因誘導衰老的分子機制，有助于人們更加深入了解腫瘤發(fā)生的本質(zhì)，并且在研究過程中可能會發(fā)現(xiàn)新靶點，為相關(guān)腫瘤的治療提供新方法。

PIM1 作為一個原癌基因在多種腫瘤中高表達，通過磷酸化多種底物在腫瘤生長、發(fā)展中起重要作用。然而，原癌基因PIM1 在細胞衰老的作用有諸多研究報道。研究者發(fā)現(xiàn)在細胞復制性衰老和原癌基因誘導的細胞衰老中，IL-6/STAT3 信號通路的激活導致PIM1 的表達顯著增加[4]。有研究發(fā)現(xiàn)，PIM1 可通過磷酸化異染色質(zhì)蛋白1（HP1）和高遷移率族盒轉(zhuǎn)錄因子1（HBP1），導致基因組不穩(wěn)定性和抑制衰老相關(guān)基因表達發(fā)生變化，進而促進細胞衰老[17-18]。此外，筆者前期的文章也發(fā)現(xiàn)PIM1 通過磷酸化泛素樣含PHD 和環(huán)指域1（UHRF1）使其穩(wěn)定性減弱，導致全基因組DNA 低甲基化，引起基因組不穩(wěn)定和p16表達量增加，從而誘發(fā)細胞衰老。然而，筆者發(fā)現(xiàn)過表達UHRF1 并不能完全消除PIM1 誘導的細胞衰老，說明PIM1 還可以通過其他機制誘導細胞衰老[5]。

在本研究中，筆者通過衰老相關(guān)蛋白的Western 印跡和衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色實驗證實原癌基因PIM1 能促進人胚肺成纖維細胞發(fā)生衰老。為了進一步闡明PIM1 誘導細胞衰老的分子機制，筆者尋找能與PIM1 結(jié)合的新蛋白，免疫沉淀聯(lián)合質(zhì)譜技術(shù)結(jié)果證實hnRNPU 是PIM1 新的結(jié)合蛋白。本研究還發(fā)現(xiàn)PIM1 能抑制hnRNPU 蛋白水平表達，而不影響其mRNA 表達水平。這些實驗結(jié)果提示hnRNPU 可能在PIM1 誘導的細胞衰老中發(fā)揮重要作用。

hnRNPU 是一個多功能結(jié)構(gòu)域的核蛋白，可以結(jié)合DNA 和RNA，參與多種基因的轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控[19]。hnRNPU 功能研究多集中于腫瘤的研究，如hnRNPU 能夠促進肝癌的發(fā)展，被認為可能是c-Myc 的一個新的轉(zhuǎn)錄靶點[20-22]。然而，hnNRPU與細胞衰老的研究甚少，近年來僅有一項研究發(fā)現(xiàn)，hnRNPU 和長鏈非編碼RNA PANDA 與多梳蛋白抑制復合體（PRC1 和PRC2）或者轉(zhuǎn)錄因子NF-YA 相互作用促進或者抑制細胞衰老[12]。因此，hnRNPU 與細胞衰老的關(guān)系還需要研究者進一步探索。

本實驗中，筆者通過衰老相關(guān)蛋白的Western 印跡和衰老相關(guān)β-半乳糖苷酶染色實驗發(fā)現(xiàn)過表達hnNRPU 能抑制PIM1 誘導的細胞衰老，證實hn－RNPU 在PIM1 誘導的細胞衰老中發(fā)揮抑制作用。筆者猜測過表達hnRNPU 可能導致其與抑制衰老相關(guān)基因的DNA 或RNA 的結(jié)合增加，從而改變抑制衰老相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄表達，進而抑制PIM1 誘導的細胞衰老，但是這種假設需要實驗進一步驗證。本研究明確了hnRNPU 在細胞衰老過程中起抑制作用，hnNRPU 的過表達可能使腫瘤細胞出現(xiàn)衰老障礙，進而增加腫瘤的發(fā)生風險。因此，針對hnRNPU 的進一步研究可能為腫瘤治療提供新線索。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)過表達hnRNPU 抑制原癌基因PIM1 誘導的細胞衰老，對探究原癌基因誘導細胞衰老的分子機制提供了一種新思路。hnRNPU 可能成為腫瘤治療的潛在靶點。