組蛋白去乙?；敢种苿〤hidamide 抑制C2C12骨骼肌細胞分化及其機制

張露露，郭洋，王新莉，牛文彥

（1.天津醫科大學基礎醫學院免疫學系，天津 300070；2.天津醫科大學朱憲彝紀念醫院消化內科，天津 300134）

骨骼肌是人體最大的組織，重量約占體重的40%，在調節機體的新陳代謝、運動、能量穩態等方面發揮著重要作用[1]。骨骼肌分化，即成肌，是一個多步驟過程，包括骨骼肌衛星細胞的激活、增殖、分化和多核肌纖維形成[2]。根據肌球蛋白重鏈（MyHC）的不同，骨骼肌主要分為四型多核肌纖維，即Ⅰ型肌原纖維（MyHC Ⅰ）、Ⅱa 型肌原纖維（MyHCⅡa）、Ⅱb 型肌原纖維（MyHC Ⅱb）和Ⅱx 型肌原纖維（MyHC ⅡIx）[3]。生肌調節因子4（MRF4）、生肌因子5（Myf5）、MyoD 和MyoG 是基本螺旋-環-螺旋轉錄因子家族成員，這些因子在胚胎發生和出生后肌發生期間調控骨骼肌細胞的決定和分化[4]。MyoD 和MyoG 的激活可促進MyHC 的表達，進而促進肌分化[5]。此外，MyoG 在調控肌纖維類型和氧化代謝中也發揮重要作用。

組蛋白去乙?；福╤istone deacetylases，HDACs）是一類蛋白酶，在染色體結構修飾和基因表達調控中發揮重要作用。人類基因組有18 種不同的HDACs，分為4 類，Ⅰ類（HDAC1、2、3、8）、Ⅱ類（Ⅱa：HDAC4、5、7、9；Ⅱb：HDAC6、10）、Ⅲ類即沉默信息調節因子2 和Ⅳ類（HDAC11）。又根據對活性的要求將其分為鋅依賴家族和輔因子NAD+依賴家族。其中Ⅰ類、Ⅱ類和Ⅳ類HDACs 為鋅依賴家族，被廣泛研究[6]。臨床研究顯示小分子HDAC 抑制劑在治療癲癇、躁郁癥、癌癥和許多其他疾病時會對骨細胞群產生影響。此外，越來越多的研究證實HDAC 在骨發育中發揮重要作用[7]。西達本胺（Chidamide）是一種新型苯甲酰胺類HDAC 抑制劑，在淋巴瘤、急性淋巴細胞白血病、軟組織肉瘤[8]、肺癌[9]中顯示出良好的治療效果，但是Chidamide 對骨骼肌發育的影響尚不明確，本研究旨在探討Chidamide 在體外對C2C12 骨骼肌細胞分化及肌纖維類型的影響和其潛在分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 小鼠骨骼肌細胞株C2C12（購自美國ATCC），胎牛血清、馬血清（以色列Bioind），DMEM 培養基（美國GIBO），二甲基亞砜（西格瑪上海有限公司），西達苯胺（中國MCE 公司），Trizol 裂解液（美國Ambion 公司），逆轉錄試劑盒、實時熒光定量RT-PCR Mix（北京TransGen Biotech），羅氏實時熒光定量PCR 儀，Actinin1 抗體（美國Sigma），MyHC、MyoG（Santa 公司），Pan-acetyl H3 抗體（Active Motif 公司），Myh7、Myh4、Myh1（Proteintech 公司），Myh2（Affinity 公司），β-actin 抗體（中國Abclonal），DAPI、熒光二抗（天津博誠科技有限公司），耦聯HRP 的山羊抗鼠抗體和山羊抗兔抗體（美國Jackson Immuno Research），增強化學發光底物檢測的試劑盒（美國Millipore），Tannon-5200 顯影儀（北京原平皓生物有限公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養與藥物處理 將C2C12 細胞接種于細胞培養板中，使用DMEM 高糖培養基（含10%胎牛血清）于37℃，5%CO2條件下培養，待細胞密度達80%時，換成DMEM 高糖培養基（含5%馬血清）培養48 h，再分別與含有二甲基亞砜（DMSO）和西達苯胺（Chidamide）的分化培養基共培養48 h。

1.2.2 CCK-8 實驗 培養瓶中細胞密度達到90%融合時消化細胞，吸取細胞進行稀釋，并在計數板中計數，按照每孔接種5×103個細胞密度，接種于96孔板中，置于細胞培養箱中培養24 h，然后加入不同濃度（0、0.5、1、2、4 μmol/L）Chidamide 孵育，48 h 后每孔加入10 μL CCK-8 試劑，培養箱中孵育2 h，用酶標儀在450 nm 波長下檢測吸光值。

1.2.3 細胞免疫熒光 將不同條件處理的C2C12細胞加入4%多聚甲醛固定，加入含0.1%Trixon 的PBS 打孔。用1%BSA 室溫封閉1 h，一抗4℃孵育過夜，第2 天，熒光二抗室溫避光孵育30 min。DAPI避光染核，顯微鏡下拍照。

1.2.4 組蛋白提取 將各組細胞用含丁酸鈉的冰PBS 沖洗兩次，離心，棄上清，收集細胞。用TEB 溶解細胞，離心，棄上清。加入0.2 mol/L 的硫酸溶液溶解蛋白，過夜提取組蛋白，然后用TCA 溶液沉淀組蛋白。將溶液離心，棄上清，用丙酮溶液沖洗沉淀，離心，棄上清。沉淀干燥，加水溶解。

1.2.5 RNA的提取和實時熒光定量PCR 收集各組細胞，每孔加入500 μL Trizol 裂解細胞，然后收集到RNase free 管，加入100 μL 氯仿，混勻后室溫靜置5 min，然后12 000 r/min 4℃離心15 min，吸取上層透明RNA 到新的RNase free 管。加入異丙醇，混勻，靜置10 min 后，離心，吸取管底的白色膠樣RNA，用75%乙醇（DEPC 水配置）重復洗兩遍后，加入20 μL 無酶水，金屬浴助溶，58℃，2 min。然后測RNA 濃度。根據逆轉錄試劑盒的操作步驟合成cDNA 并稀釋5 倍。以逆轉錄后的cDNA 為模板，按照實時熒光定量PCR 的說明書配置20 μL 反應體系并進行擴增。根據qPCR 得出的熒光曲線Ct 值，以GAPDH 基因為內參，用2-ΔΔCt計算結果。所用的引物序列見表1。

表1 擴增反應所需引物序列Tab 1 Primer sequences for amplification reaction

1.2.6 Western 印跡 收集各組細胞，用RIPA 裂解液（含蛋白酶抑制劑）裂解細胞并提取總蛋白。制備10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳，PVDF 轉膜，轉膜后，用5%牛血清白蛋白室溫封閉1 h，一抗（β-actin按1∶5 000 比例，Actinin1 按1∶5 000 比例，MyHC、MyoG 按1∶500 比例，Myh7、Myh4、Myh1 按1∶1 000比例，Myh2 按1∶2 000 比例，用1%BSA 稀釋配置）4℃過夜孵育，次日，二抗室溫孵育2 h，然后ECL 顯色后曝光，Image J 進行定量分析。

1.3 統計學處理 采用GraphPad Prism6 統計軟件進行統計分析，符合正態分布的計量資料均以表示，兩組間均數比較采用t 檢驗，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Chidamide 對C2C12 細胞活力和組蛋白乙?；?水平 的影響 CCK-8 檢測不同濃度（0、0.5、1、2、4 μmol/L）Chidamide 對C2C12 細胞活力的影響（圖1A），結果顯示，不同濃度的Chidamide 不影響C2C12 細胞活力（F=0.058，P＞0.05），選用4 μmol/L Chidamide 作為后續實驗濃度。Western 印跡結果顯示，Chidamide 顯著升高Pan-acetyl H3 蛋白水平 （t=3.22，P＜0.05）（圖1B）。

圖1 Chidamide 對細胞活力和Pan-acetyl H3 水平的影響Fig 1 Effects of Chidamide on cell viability and Pan-acetyl H3 levels

2.2 Chidamide 對C2C12 細胞分化的影響 結果顯示，與對照組相比，Chidamide 組MyHC 陽性的肌纖維明顯減少，肌細胞融合受損，融合指數降低，推測Chidamide 可能抑制C2C12 細胞的分化（圖2A）。進一步檢測MyHC 的蛋白和mRNA 的表達，發現與對照組相比，Chidamide 組MyHC 的mRNA 水平顯著降低（t=26.87，P＜0.01），MyHC 蛋白水平也顯著降低（t=5.71，P＜0.01，圖2B、2C）。

圖2 Chidamide 對MyHC 表達的影響Fig 2 Effect of Chidamide on MyHC expression

2.3 Chidamide 對C2C12 細胞分化相關蛋白的影響 與對照組相比，Chidamide 組MyoD 和MyoG 的mRNA 水平顯著降低（t=5.81、4.86，均P＜0.01），蛋白水平也顯著降低（t=6.05、7.37，均P＜0.01），見圖3。

圖3 Chidamide 對MyoD 和MyoG 的影響Fig 3 Effect of Chidamide on MyoD and MyoG expression

2.4 Chidamide 對Ⅰ型肌原纖維的影響 與對照組相比，Chidamide 組Myh7 的mRNA 水平顯著降低（t=4.85，P＜0.01），其蛋白水平也顯著降低（t=3.93，P＜0.01），見圖4。

圖4 Chidamide 對Myh7 的影響Fig 4 Effect of Chidamide on Myh7 expression

2.5 Chidamide 對Ⅱ型肌原纖維的影響 與對照組相比，Chidamide 組Myh1 和Myh2 的mRNA 水平顯著降低（t=15.48、16.82，均P＜0.001，圖5A），蛋白水平也顯著降低（t=14.13、5.05，均P＜0.01，圖5B），但Chidamide 不影響Myh4 的mRNA 水平（t=1.50，P＞0.05，圖5C）和蛋白水平（t=2.19，P＞0.05，圖5D）。

圖5 Chidamide 對Myh1、Myh2 和Myh4 的影響Fig 5 Effect of Chidamide on the expression of Myh1,Myh2 and Myh4

3 討論

在表觀遺傳機制中，組蛋白去乙?；驯蛔C明影響肌肉再生[10]。有文獻報道，HDAC1 通過叉頭盒蛋白3a（FoxO3a）誘導肌肉萎縮[11]；HDAC3 調節骨骼肌能量代謝[12]；敲降HDAC4 通過抑制MyoG 依賴性萎縮基因激活來緩解去神經誘導的肌肉萎縮[13]。組蛋白去乙酰化酶抑制劑MS-275 通過下調破骨細胞生成轉錄因子（c-Fos）表達，防止破骨細胞生成并抑制小鼠骨質流失。組蛋白去乙?；敢种苿┍焖嵬ㄟ^抑制癌癥惡病質中CCAAT/增強子結合蛋白β（C/EBPβ）調節的萎縮基因1（Atrogin1）表達，減輕骨骼肌萎縮[14]。組蛋白去乙酰化酶抑制劑曲古抑菌素A 通過凋亡信號調節激酶1（ASK1）-絲裂原活化蛋白激酶3/4/6（MKK3/4/6）-c-Jun 氨基末端激酶（JNK）和p38 絲裂原活化蛋白激酶（p38 MAPK）途徑在分化的C2C12 肌細胞中轉錄激活肌肉生長抑制素（MSTN）[15]。

Chidamide 是Ⅰ類（HDAC1、2、3） 和Ⅱb 類（HDAC10）HDAC 抑制劑，對骨骼肌細胞分化的影響未見報道。本研究檢測了不同濃度Chidamide 對細胞活力的影響，發現Chidamide 不影響細胞活力并且使組蛋白乙?；缴摺Ｍㄟ^細胞免疫熒光MyHC 染色，發現Chidamide 使MyHC 陽性肌纖維的比例降低，使肌細胞融合受損，推測Chidamide 可能抑制C2C12 細胞分化。接下來筆者進一步檢測了MyHC 的mRNA 和蛋白水平，發現Chidamide 處理后顯著降低MyHC 的表達，結果與其免疫熒光染色結果一致，說明Chidamide 抑制C2C12 細胞分化。

肌源性分化是骨骼肌發育的一個重要過程，它決定了成肌細胞命運、肌肉形成和再生。肌源性調節因子Myf5、MyoD、MyoG、MRF4 調控骨骼肌細胞增殖、分化和融合[16]。MyoD 在肌分化早期表達，結合下游靶基因啟動子中的E-box 序列，從而與肌細胞增強因子2（Mef2）轉錄因子協同驅動肌肉相關基因的轉錄，進而促進肌分化；MyoG 表達較晚，是骨骼肌分化所必需的因子，通過促進成肌細胞融合和肌纖維形成來促進分化。根據文獻報道，C2C12 細胞中MyoG 的轉錄激活會增強肌分化[17]；HDAC11 通過抑制MyoD 依賴性轉錄來抑制成肌細胞分化[18]。因此，筆者檢測了MyoD、MyoG 的mRNA 和蛋白水平，發現Chidamide 顯著下調MyoD 和MyoG 的表達，鑒于MyoD 和MyoG 在C2C12 細胞分化中發揮正調控作用，提示Chidamide 可能通過下調MyoD 和MyoG的表達抑制C2C12 細胞分化。

根據收縮特性，哺乳動物肌纖維分為慢氧化型（MyHC Ⅰ型）、快氧化型（MyHC Ⅱa 型）、中間型（MyHC Ⅱx 型）和快速糖酵解型（MyHC Ⅱb 型）肌纖維。與糖酵解或中間型肌纖維相比，氧化型肌纖維富含線粒體和毛細血管，抗疲勞能力更強，更依賴氧化磷酸化產生能量。骨骼肌纖維類型轉化與人體肌肉和代謝性疾病有直接關系。肌肉廢用，如脊髓損傷，導致Ⅰ型纖維萎縮，纖維類型從慢到快轉變，而癌癥惡病質導致Ⅱ型纖維優先萎縮，纖維類型從快到慢轉變[19]。因此，本研究進一步檢測Chidamide 處理C2C12 細胞后對肌原纖維的影響。結果顯示，與對照組相比，Chidamide 顯著降低Myh7、Myh1 和Myh2 的表達，但不影響Myh4 的表達。表明Chidamide 抑制Ⅰ型、Ⅱx 型、Ⅱa 型肌原纖維，不影響Ⅱb 型肌原纖維，提示Chidamide 對各型肌纖維類型有不同的影響。

綜上所述，本研究證明Chidamide 抑制C2C12骨骼肌細胞分化，且主要抑制Ⅰ型、Ⅱa 型、Ⅱx 型肌原纖維，但不影響Ⅱb 型肌原纖維，其機制可能與Chidamide 下調MyoD 和MyoG 的表達有關。