基于RNA-seq 探討扶腎降濁方及蚓激酶對腎間質纖維化的作用機制

王超坤，劉婷婷，帥一塵，李春雨，蘇瑋蓮，寧志芬，李國霞

（天津醫科大學基礎醫學院藥理學系，天津 300070）

腎間質纖維化（renal fibrosis，RF）是各種慢性腎臟疾病（chronic kidney disease，CKD）進展至腎功能衰竭的共同途徑[1]。RF 是CKD 進展的標志，RF 進展與腎功能惡化密切相關[2]。在持續的慢性炎癥過程中，腎小管上皮細胞發生了上皮-間充質轉化（epithial-mesenchymal transition，EMT），同時，肌成纖維細胞的形成，造成細胞外基質（extra cellular matrix，ECM）產生過多，降解減少，過量的ECM 沉積，損害了腎實質，導致RF 發生[3-4]。目前導致ECM 積聚的確切機制及基因調控靶點尚不十分清楚，西醫尚無治療腎纖維化的有效治療措施[5]。

課題組前期對扶腎降濁方、蚓激酶治療腎纖維化分別進行了多項研究，結果表明，扶腎降濁方、蚓激酶對腎纖維化均具有很好的治療作用[6-7]，但扶腎降濁方、蚓激酶治療腎纖維化的各自優勢及聯合用藥是否具有協同作用尚不十分清楚。本研究旨在以往研究基礎上，對扶腎降濁方、蚓激酶及聯合用藥治療腎纖維化的作用優勢、作用基因靶點及相關機制做進一步研究。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 動物 SPF 級Sprauge-Dawley（SD）雄性大鼠60 只，體重190～210 g，購自北京斯貝福生物技術有限公司，動物合格證書編號：SCXK（京）2019-0010，常規飼養，動物房溫度23℃，濕度40%，光照和黑暗按12 h 循環交替，自由飲水，自由獲取飼料。經適應性喂養1 周后開始實驗。動物實驗方案經天津醫科大學動物倫理委員會批準（編號：TMUaMEC 2022005）。

1.1.2 藥物與試劑 扶腎降濁方組成：山茱萸12 g，生黃芪30 g，白花蛇舌草30 g，丹參30 g，鬼箭羽30 g，益母草30 g，由天津藥物研究院中藥現代研究部按既定工藝制備成濃縮劑，每克含生藥量為3.32 g。蚓激酶腸溶液膠囊購自北京百奧藥業有限公司（批號：H11021129）。大鼠的給藥劑量按70 kg人體表面積換算[8]。根據前期實驗結果，扶腎降濁方、蚓激酶在高劑量時抑制RF 的效果最佳[7，9]，故本實驗采用高劑量。抗體β-actin、α-SMA，abcam公司（批號：ab8226、ab7817）；抗體Collagen-1，Affinity 公司（批號：AF7001）；抗體Vimentin、纖連蛋白（Fibronectin）、Flna、纖溶酶原激活物抑制劑-1（PAI-1）、磷酸化細胞外信號調節激酶（p-ERK）、細胞外信號調節激酶（ERK），Immunoway 公司（批號：YT4879、YT1733、YT1625、YT3569、YT1625、YP0101）；E-cad、兔抗IgG，Saierbio 公司（批號：SRP05266、SRPGAR001）。蘇木素，上海源葉生物科技有限公司（批號：S19007）；水溶性伊紅染色液，北京鼎國昌盛生物技術有限公司（批號：AR-0733）；Masson 三色染色液，索萊寶生物科技有限公司（批號：G1340）。

1.1.3 儀器 細胞培養箱，美國Thermo 公司（型號：YZB/USA1802-2009）；正置顯微鏡，日本尼康株式會社（型號：LV150NL）；電泳儀，中國北京六一生物科技有限公司（型號：DYCP-31BN）；組織脫水機，德國Leica 公司（型號：TP1020）；加熱石蠟包埋機，德國Leica 公司（型號：EG1150C）；手動輪轉式切片機，德國Leica 公司（型號：RM2235）。

1.2 方法

1.2.1 動物模型制備 大鼠經適應性喂養1 周后采用如下方法對其進行腎間質纖維化造模：大鼠全麻誘導后，在模型組大鼠腹部正中切開，露出左腎，在上、下1/3 處結扎左輸尿管，兩次結扎點之間切斷輸尿管，切口用5-0 線縫合，在傷口處涂碘伏消毒[10]。假手術組大鼠采用相同的手術方式但不結扎輸尿管。除假手術組外，其余各組大鼠均進行腎間質纖維化造模。

1.2.2 分組與干預 將大鼠隨機分為假手術組、模型組、扶腎降濁方組、蚓激酶組和聯合用藥組，每組12只。對假手術組大鼠進行輸尿管游離，對其他組大鼠進行腎間質纖維化造模。造模后第2 天開始給藥，扶腎降濁方灌胃給藥：29 g/（kg·d），蚓激酶腹腔注射給藥：360 000 U/（kg·d），假手術組、模型組給予等體積生理鹽水，每天給藥1次。術后第7 天及14 天各組分別處死6 只大鼠。在無菌操作臺上迅速打開腹腔，在距腎門1 mm 切取左側梗阻腎臟，用生理鹽水沖洗后，沿矢狀面切開，分為等量的兩份，分別放入無菌微型離心管中，一份用液氮快速冷卻后保存于-80℃冰箱，用于Western 印跡實驗，另切取黃豆大小組織用于轉錄組測序，一份放入4%多聚甲醛液固定24 h，用于病理學實驗。

1.2.3 檢測指標與方法

1.2.3.1 腎組織病理學評估：腎臟標本在4%多聚甲醛液中固定24 h，常規修塊，脫水，浸蠟，包埋，將樣品切成4 μm 厚的切片，HE 染色觀察腎臟皮質、髓質和腎小管等情況；Masson 染色觀察膠原纖維分布情況。在光學顯微鏡下觀察Masson 三色染色切片，并在200×放大鏡下拍照。從整個切片中選取5 個視野，藍染面積百分比計算為總陽性面積/總分析面積的百分比。

1.2.3.2 分析各治療組差異表達基因：取給藥7 d 時的模型組及治療組大鼠的腎臟組織，切取黃豆大小樣本，每組設置兩個生物學重復，轉移到離心管中送至中國華大生物科技公司進行測序分析，進行RNA 的提取與檢測、反轉錄、PCR 富集、構建文庫，最后上機檢測。分析扶腎降濁方組、蚓激酶組及聯合用藥組相比模型組差異表達的基因。

1.2.3.3 Western 印跡：檢測梗阻側大鼠腎組織PAI-1、Collagen-1、Fibronectin、E-cad、α-SMA、Vimentin、Flna、ERK 和p-ERK 的表達，取腎組織標本加入預冷的RIPA 裂解緩沖液，研磨后靜置于冰上裂解60 min，4℃，12 000×g 離心，取上清。BCA 法測定蛋白濃度。10%SDS-PAGE 膠進行電泳蛋白分離，并將目的蛋白轉移至PVDF 膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后，將膜與一抗PAI-1、Collagen-1、Fibronectin、Ecad、α-SMA、Vimentin、Flna、p-ERK 和ERK，濃度均為1：1 000，β-actin（1∶10 000）4℃孵育過夜。用TBST 洗膜4 次，每次5 min。將印記與耦聯于辣根過氧化物酶的二抗[羊抗兔IgG（1∶10 000）]室溫孵育2 h。用TBST 洗膜4 次，每次5 min。按ECL 試劑盒說明進行顯影，用X 感光膠片在暗室內進行曝光。以β-actin 為內參進行條帶灰度分析。將目標條帶與參考條帶的灰度比值作為蛋白的相對表達，用Image J 14.1 軟件進行圖片處理。

1.3 統計學處理 采用SPSS20.0 軟件對數據進行統料計用分析表，符示合，各正組態間分比布較或采近用似單因正素態方分差布分的析計，量兩資兩比較采用t 檢驗，P＜0.05 表示差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠腎臟病理組織形態學

2.1.1 HE 染色 假手術組腎小管結構正常，排列整齊緊密，未見擴張或萎縮，未見間質炎癥細胞浸潤。模型組腎小管上皮細胞腫脹脫落、變性壞死，致結構被破壞，伴有炎癥細胞浸潤，隨造模時間地延長，模型組纖維化程度進一步加重。扶腎降濁方、蚓激酶和聯合用藥均可不同程度地減輕腎纖維化。第7 天，扶腎降濁方組纖維化減輕更為突出，隨著纖維化程度的加重，扶腎降濁方組作用減弱，到第14 天時，蚓激酶組纖維化改變較扶腎降濁方組輕。此外，第7、14 天，均以聯合用藥效果最佳，見圖1。

圖1 各治療組術后7 d，14 d 腎臟病理改變(HE 染色，200×)Fig 1 Renal pathological changes in 7 d，14 d among groups (HE staining，200×)

2.1.2 Masson 染色 假手術組腎小管周圍間質未見藍色膠原纖維沉積；模型組間質可見較多藍色膠原纖維染色，且隨造模時間地延長藍染面積進一步加重（P＜0.01）。與模型組比較，扶腎降濁方組、蚓激酶和聯合用藥組纖維化藍染面積均有不同程度的減輕（P＜0.01 或P＜0.05）。第7 天，與蚓激酶組相比，扶腎降濁方組纖維化藍染面積明顯降低（P＜0.01）。第14天，蚓激酶組較扶腎降濁方組纖維化藍染面積降低（P＜0.05）。兩個時間段均以聯合用藥后纖維化藍染面積最小（P＜0.05 或P＜0.01），見圖2。

圖2 各組腎臟病理改變（Masson 染色，200×）Fig 2 Renal pathological changes in each group（Masson staining，200×）

2.2 各組大鼠ECM 相關蛋白表達 通過檢測ECM 標志物PAI-1、Collagen-1 和纖連蛋白的表達量進一步了解藥物對RF 中ECM 異常積聚的作用。與假手術組相比，模型組PAI-1、Collagen-1 和纖連蛋白的表達量明顯增加（P＜0.01）。扶腎降濁方組、蚓激酶組及聯合用藥組可顯著降低PAI-1、Collagen-1 和纖連蛋白的表達（P＜0.01 或P＜0.05）。第7 天，相比蚓激酶組，扶腎降濁方組PAI-1、Collagen-1 和纖連蛋白的表達量較低（P＜0.01 或P＜0.05）。第14 天，蚓激酶組PAI-1、Collagen-1 和纖連蛋白的表達量較扶腎降濁方組低，但無統計學意義（P＞0.05）。兩個階段均以聯合用藥PAI-1、Collagen-1 和纖連蛋白的表達量最低（P＜0.01 或P＜0.05），見圖3。

圖3 各組PAI-1、Collagen-1 和Fibronectin 蛋白表達Fig 3 The expression of PAI-1,Collagen-1and Fibronectin in each group

2.3 各組UUO 大鼠EMT 相關蛋白表達 通過檢測EMT 標志物E-cad、α-SMA、Vimentin 蛋白的表達量進一步了解藥物對RF 中EMT 的作用。與假手術組相比，模型組α-SMA 和Vimentin 的表達量明顯增加，E-cad 的表達量明顯降低（P＜0.01）。扶腎降濁方組、蚓激酶組及聯合用藥組可顯著降低α-SMA 和Vimentin 的表達，促進E-cad 的表達（P＜0.01 或P＜0.05）。第7 天，相比蚓激酶組，扶腎降濁方組α-SMA 和Vimentin 的表達較低，E-cad的表達較高（P＜0.01）。第14 天，蚓激酶組α-SMA和Vimentin 的表達較扶腎降濁方組低，E-cad 的表達較扶腎降濁方組高（P＜0.01 或P＜0.05）。第7、14 天均以聯合用藥組α-SMA 和Vimentin 的表達量最低，E-cad 的表達量最高（P＜0.01 或P＜0.05），見圖4。

圖4 各組α-SMA、Vimentin 和E-cad 蛋白表達Fig 4 The expression of α-SMA,Vimentin 和E-cad in each group

2.4 模型組和給藥組大鼠基因轉錄本差異表達情 況 與模型組相比，扶腎降濁方組有136 個轉錄本差異表達，蚓激酶組有836 個轉錄本差異表達，扶腎降濁方聯合蚓激酶組有1 011 個轉錄本差異表達。筆者選取了這3 個區間的交集，共30 個轉錄本。與模型組相比，相對于其他轉錄本，Flna 在3 個治療組中均明顯降低，見圖5。

圖5 針對模型組和治療組的轉錄組測序分析Fig 5 Transcriptome sequencing analysis for model group and treatment group

2.5 各組大鼠Flna 基因表達量及ERK 信號通路 與假手術組相比，模型組Flna 和p-ERK 蛋白的表達量明顯增加（P＜0.01）。扶腎降濁方、蚓激酶及聯合用藥可顯著降低Flna 和p-ERK 蛋白的表達（P＜0.01或P＜0.05）。第7 天，與蚓激酶組相比，扶腎降濁方組Flna 和p-ERK 蛋白的表達量較低（P＜0.05）。第14 天，蚓激酶組Flna 和p-ERK 蛋白的表達量較扶腎降濁方組低（P＜0.01 或P＜0.05）。第7、14 天均以聯合用藥組Flna 和p-ERK 蛋白的表達量最低（P＜0.01 或P＜0.05），見圖6。

3 討論

腎間質纖維化是慢性腎病嚴重程度的重要標志[11]，也是臨床上治療和預防進展性慢性腎病的關鍵。腎間質纖維化的病理特征是ECM 合成增多與降解減少，表現為細胞與基質相互作用失調，炎性細胞浸潤和固有細胞轉化[12-13]，而ECM 的合成與降解是一個復雜的調控體系，目前，對ECM 調控機制的認知并不十分清楚，如ECM 來源途徑存在爭議、各種細胞因子及其形成信號通路的作用機制尚未完全闡明。其中，細胞EMT 是組織發生纖維化的一種重要方式，在EMT 過程中，上皮細胞向間充質細胞轉分化，其主要特征是上皮表型的破壞和間質表型的獲得[14]。E-cad 參與上皮細胞的黏附，其表達的減少導致上皮細胞特性的喪失，活化的成纖維細胞轉化為肌成纖維細胞，其可表達α-SMA[15-16]。Vimentin 是間充質細胞骨架蛋白的重要組成部分[17]。由此，E-cad 表達的減少而Vimentin 和α-SMA 表達的增加被認為是EMT 的特征[18-19]。

文獻報道Flna 是一種非肌性肌動蛋白結合蛋白，廣泛存在于細胞漿，少數跨膜或存在于細胞核內，在細胞黏附、ECM 重塑以及細胞骨架重建中發揮重要作用，在肺癌細胞中，它促進TGF-β 誘導的EMT 進程[20]。Flna 可以通過促進MAPK 家族中ERK的磷酸化從而激活ERK 信號通路，而ERK 信號通路與纖維化密切相關。有文獻報道，Flna 作為中央調節器在平衡ECM 的產生和重塑中起重要作用，可能通過激活RAS/MEK/ERK 信號通路而實現的[21-22]。

本研究表明，扶腎降濁方、蚓激酶及聯合用藥對RF 具有顯著療效，建模7 d 治療組療效優于建模14 d，以中藥組及聯合用藥組作用更為突出，隨著纖維化程度的加重，中藥組作用減弱，蚓激酶組及聯合用藥組作用明顯，提示早期進行藥物干預，尤其是中藥干預，治療效果較好，且聯合用藥在各期效果均優于單獨用藥。

為進一步闡明藥物作用機制，課題組采用轉錄組測序技術，在UUO 大鼠模型中分析扶腎降濁方、蚓激酶及聯合用藥調控RF 所涉及的基因表達差異，結果顯示，相比模型組，扶腎降濁方、蚓激酶及聯合用藥組轉錄本Flna 的表達均顯著降低，同時Flna 蛋白表達也均明顯降低，推測Flna 可能在RF 中發揮核心調控作用，扶腎降濁方與蚓激酶可能通過調控共同基因靶點Flna 而起到治療RF作用。

研究表明，Flna 是ECM 合成和重塑的中心調節因子，在ERK 和Smad 的激活中起平衡作用[23]，而Flna 的下游信號通路—RAS/MEK/ERK 可調控腎纖維化[24]。本研究發現，扶腎降濁方、蚓激酶及聯合用藥引起Flna 降低的同時造成Collagen-1、PAI-1、FN、α-SMA、Vimentin、p-ERK 蛋白的明顯減少，E-cad 蛋白明顯升高，推測藥物可能通過調控Flna基因抑制ERK 的磷酸化水平、抑制表型轉化、減少ECM 積聚而起到治療RF 作用，進一步證明聯合用藥優勢，為RF 的治療提供科學依據。