STAT4 rs3024877 單核苷酸多態性與ANCA 相關性血管炎的關系

曹越琦，薛超

（1.天津醫科大學第二醫院腎臟病血液凈化科，天津 300211；2.廣西醫科大學第二附屬醫院腎內科，南寧 530007）

原發性抗中性粒細胞胞漿抗體（anti-neutrophi cytoplasmic antibodies，ANCA）相關性血管炎（ANCA associated vasculitis，AAV）是一類可引起多臟器病變的自身免疫性疾病，突出特點為血管壁內皮受損及纖維素樣壞死[1]，臨床表現復雜。隨著醫療水平的提高，AAV 的確診率呈逐年上升趨勢，但其發病機制至今尚未明確，全基因組關聯（GWAS）研究使AAV 的發病機制有跡可循，提示遺傳多態性在AAV的發生發展中起到不可或缺的作用，且與ANCA 抗原特異性相關[2]。

信號轉導和轉錄激活因子4（signal transducer and activator of transcription 4，STAT4）基因編碼的蛋白可參與多種免疫細胞的分化，調節多種細胞因子的信號轉導，如病原體反應及細胞因子分泌[3-4]。目前國內外有文獻報道，STAT4 基因多態性與哮喘、類風濕關節炎等多種自身免疫性疾病易感性相關[5]，但在AAV 中的研究較少。本課題組既往研究發現，STAT4 rs10181656 基因多態性與AAV 易感性相關[6]，故推測STAT4 基因可能在AAV 發生、發展過程中起到重要作用，為發掘更多與AAV 遺傳易感性相關的STAT4 基因點位，故本研究選取STAT4 rs3024877 位點進行研究。

1 對象與方法

1.1 研究對象 選擇2005 年1 月—2018 年12 月于廣西醫科大學第二附屬醫院就診的AAV 患者共145 例為AAV 組，入選標準：診斷符合2018 年第二屆Chapel Hill 國際血管炎命名會議[7]；ANCA 陽性；原發性AAV。對照組為216 名本院同期體檢中心的健康志愿者。排除標準：腫瘤、感染、其他原因所致的繼發性血管炎、多臟器衰竭及妊娠狀態。本研究經廣西醫科大學第二附屬醫院醫學倫理委員會批準（2013-KY-國基-040），全體納入對象均知情同意。

1.2 資料收集 收集患者一般資料：年齡、性別、收縮壓/舒張壓。實驗室數據：血常規、肝腎功能、補體、免疫球蛋白。腎臟穿刺病理結果：按2010 年AAV腎臟病理分類法，分為局灶型、新月體型、混合型和硬化型[8]。

1.3 基因組DNA 提取 使用DNA 提取試劑盒[北京天根生化公司]，保存符合吸光度值（A260/A280）為1.7～1.9，質量濃度＞25 mg/L 的DNA[Nanodrop 2000]。

1.4 基因分型 基因分型采用MPCR-HTS 法，生工生物工程（上海）有限公司完成[9]。步驟：設計引物序列，上游引物：5'-GAGGTTTAGGGAAAGGAGGTG AG-3'，下游引物：5'-ATCCTCATAAAACAATCACCACTAAACTCA-3'。合成引物池，采用兩步PCR 法完成STAT4 rs3024877 序列擴增和兼容Illumina測序文庫的制備。（1）PCR 體系：DNA 模板2 μL；上游引物池1 μL；下游引物池1 μL；2×PCRReady Mix 15 μL；RNase-free H2O 6 μL。擴增：PCR 儀（BIORAD，T100TM）：98℃預變性5 min；98℃變性30 s，50℃退火30 s，72℃延伸30 s，共8 個循環；98℃變性30 s，66℃退火30 s，72℃延伸30 s，共25 個循環；72℃延伸5 min，4℃保存，電泳，磁珠[AMPure XP]純化回收PCR 產物。（2）反應體系：第一輪PCR 產物2 μL，通用P7 引物1 μL；通用P5 引物1 μL；2×PCR Ready Mix 15 μL；RNase-free H2O 11 μL。擴增程序：98℃預變性5 min；94℃變性30 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，共5 個循環；72℃延伸5 min，4℃保存，磁珠[AMPure XP]純化回收PCR 產物，HiSeq XTen 測序儀（Illumina，SanDiego，CA）測序[10]。

1.5 統計學處理 SPSS 22.0 用于數據分析，Hardy-Weinberg 平衡以P＞0.05 為群體有代表性。計量資料數據進行正態性檢驗，符合正態分布的以x±s 表示，兩樣本數據比較采用t 檢驗，多樣本的組間比較采用方差分析；偏態分布數據以M（P25，P75）表示，比較采用K-W 秩和檢驗。計數資料以n（%）表示，組間比較采用χ2檢驗或Fisher確切概率法。Logistic 回歸分析用于評估基因多態性與腎臟病理的關系，P＜0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 患者資料 AAV 組中男性59 例，女性86 例。男性患者具有更高的白細胞和紅細胞水平，女性患者具有更高的免疫球蛋白M 水平（P＜0.05），見表1。

表1 AAV 患者的資料[±s，M（P25，P75）]Tab 1 The data of AAV patients[±s，M（P25，P75）]

表1 AAV 患者的資料[±s，M（P25，P75）]Tab 1 The data of AAV patients[±s，M（P25，P75）]

注：1 mmHg=0.133 kPa

指標 男（n=59） 女（n=86） t/Z P年齡（歲） 53.41±15.15 54.38±14.92 -0.39 0.70收縮壓（mmHg） 134.58±25.14 80.80±15.14 -0.43 0.67舒張壓（mmHg） 135.09±22.75 78.03±11.61 -0.87 0.38血紅蛋白（g/L） 75.60（66.00，113.00） 77.05（61.76，91.50） -1.90 0.06肌酐（μmol/L） 304.00（112.00，727.00）257.50（98.75，443.50） -1.69 0.09白細胞（×109/L） 8.80（6.29，11.40） 7.35（5.52，9.91） -2.00 0.04紅細胞（×109/L） 2.90（2.37，3.90） 2.69（2.22，3.32） -1.99 0.04尿素氮（mmol/L） 15.00（5.76，25.79） 12.69（5.92，25.38） -1.25 0.21白蛋白（g/L） 28.93±7.45 30.89±5.88 -1.76 0.08補體C3（g/L） 0.97（0.79，1.12） 0.92（0.81，1.09） -0.94 0.35補體C4（g/L） 0.30（0.24，0.40） 0.29（0.22，0.38） -1.00 0.32免疫球蛋白G（g/L） 13.15±6.65 14.86±4.92 -1.67 0.10免疫球蛋白A（g/L） 2.36（1.71，2.90） 2.50（1.73，3.25） -0.91 0.36免疫球蛋白M（g/L） 0.92（0.59，1.40） 1.15（0.74，1.64） -2.00 0.05

2.2 AAV 組基因型間實驗室指標比較 該位點不同基因型間實驗室指標差異均無統計學意義（均P＞0.05），表2。

表2 AAV 組基因型間實驗室指標比較[±s，M（P25，P75）]Tab 2 Comparison of laboratory indicators between genotypes in patients[±s，M（P25，P75）]

表2 AAV 組基因型間實驗室指標比較[±s，M（P25，P75）]Tab 2 Comparison of laboratory indicators between genotypes in patients[±s，M（P25，P75）]

指標 TT F 或χ2 P血紅蛋白（g/L） 70.45（59.00，94.40） 4.28 0.12肌酐（μmol/L） 340.00（120.00，586.00） 4.15 0.13白細胞（×109/L） 7.51（5.55，11.09） 0.30 0.86紅細胞（×109/L） 2.77（2.16，3.59） 1.76 0.42尿素氮（mmol/L） 17.28（8.24，28.63） 5.72 0.06白蛋白（g/L） 31.14±6.97 0.52 0.60補體C3（g/L） 0.91（0.75，0.98） 5.35 0.06補體C4（g/L） 0.25（0.19，0.31） 4.67 0.10免疫球蛋白G（g/L） 13.28（11.19，16.45） 0.28 0.87免疫球蛋白A（g/L） 2.45（1.46，3.32） 0.02 0.99免疫球蛋白M（g/L） 1.07（0.69，1.38） 0.08 0.96 CT 82.00（66.75，99.70）225.00（92.50，436.00）8.11（5.87，11.03）2.82（2.37，3.65）12.26（5.02，20.53）29.78±7.06 0.99（0.84，1.16）0.31（0.24，0.38）14.57（10.29，16.74）2.46（1.70，3.08）1.13（0.70，1.48）CC 72.00（60.60，101.03）333.00（125.00，625.50）8.00（5.79，10.50）2.63（2.27，3.40）15.06（7.82，24.98）29.83±5.60 0.87（0.75，1.09）0.29（0.23，0.42）13.60（9.47，19.92）2.36（1.92，3.15）1.04（0.64，1.62）

2.3 兩組間基因型及等位基因頻率分布 對照組（χ2=0.496，P=0.481）、AAV 組（χ2=0.252，P=0.615）均符合Hardy-Weinberg 平衡，兩組間基因型、等位基因頻率分布無明顯差異（P＞0.05），見表3。

表3 兩組間基因型、等位基因分布[n（%）]Tab 3 Distribution of genotype and allele between two groups[n（%）]

2.4 基因多態性與AAV 易感性 經Logistic 回歸分析發現，與CC（野生純和型）對比，TT、CT 基因型與AAV 易感性無關；以等位基因C 為參照，T 與AAV 易感性無關（均P＞0.05），見表4。

表4 基因多態性與AAV 的Logistic 回歸分析Tab 4 Logistic regression analysis of gene polymorphism of AAV

2.5 各病理類型間基因型、等位基因頻率分布 基因型在各病理類型間的分布有統計學意義（P=0.001），等位基因在各病理類型間的差異有統計學意義（P=0.003），見表5。

表5 各病理類型間基因型、等位基因頻率分布[n（%）]Tab 5 Distribution of genotype and allele frequencies between pathological types[n（%）]

2.6 等位基因與病理類型相關性 以等位基因為自變量，病理類型為因變量做Logistic 回歸分析，以C 等位基因為參照，T 為新月體型的危險因素（P=0.004），T 為混合型的危險因素（P=0.041），見表6。

表6 等位基因與病理類型的Logistic 回歸分析Tab 6 Logistic regression analysis of allele frequencies and pathological types

2.7 基因型與病理類型相關性 以基因型為自變量，病理類型為因變量做Logistic 回歸分析，以CT+CC 基因型為參照，TT 為新月體型的危險因素（P=0.003），TT 為混合型的危險因素（P=0.009），見表7。

表7 基因型與病理類型的Logistic 回歸分析Tab 7 Logistic regression analysis of genotype frequencies and pathological types

3 討論

STAT4 是STAT 家族中重要一員，在各類炎性過程中均可見其身影，例如病原體反應、細胞因子分泌等[11]。STAT4 定位于細胞質，作為唯一組織限制性表達的STAT，該基因所編碼的蛋白被確定為DNA 結合蛋白的主要成分，其mRNA 在單核、淋巴、巨噬細胞中表達[12]，參與細胞增殖、分化、凋亡。多種細胞因子與細胞膜結合后使得STAT4 被磷酸化，而后二聚化的STAT4 易位至細胞核，被激活的STAT4 具有炎癥作用，參與所有已知的IL-12 的生物學功能，參與自然殺傷細胞、肥大細胞、樹突狀細胞和T 輔助細胞（Th）的功能調節和分化，導致Th1/Th2 分化率向Th1 側轉移，激活特定的Th1 分化并抑制Th2 反應[13]，而Th1 細胞功能失調可誘導多種自身免疫性疾病，其主要表達于炎癥部位的免疫調節細胞中[14]，由此推測，STAT4 在AAV 發生、發展中扮演重要的角色。

本研究雖然未發現STAT4 rs3024877 基因多態性與AAV 易感性相關，但與其他自身免疫性疾病發病的相關研究已開展。有學者研究發現，STAT4 rs3024877 基因多態性與中國女性患者系統性紅斑狼瘡（SLE）易感性顯著相關[15]。隨著深入研究發現，STAT4 基因第14 內含子至第17 外顯子區域（包含rs3024866、rs3024877、rs3024886）具有與SLE 發病風險較高的關聯性[16]。在東西方人群中，對比研究人類基因組單倍型圖（haplotype map，Hapmap），提示STAT4 基因位點單核苷酸多態性分布頻率及不同基因間的連鎖呈現出明顯地域差異，我國北京漢族人群（CHB）的SLE 風險SNPs 頻率相較于歐裔（CEU）呈明顯增多的趨勢，如rs3024877 中，CEU 為33.1%，CHB 為44.4%[17]。截然不同的是，我國臺灣人群特發性膜性腎病（IMN）中，STAT4 rs3024877 并未發現與疾病易感性相關，而STAT4 rs3024908 的基因型分布在AAV 組及對照組間有差異，且AA 基因型是疾病的風險因素[18]。

AAV 腎損害較為常見，據既往病理學研究發現，中性粒細胞胞外陷阱大量附著于AAV 患者的腎小球及間質中，可反向參與ANCA 的產生，與組蛋白DNA、中性粒細胞顆粒蛋白等結合，介導靶器官的血管損傷，相較于其他臟器，腎臟自身可分泌炎癥因子、腫瘤壞死因子等，這些物質或為腎臟受損易感性的病理基礎，導致腎臟損害具有特殊性[19]。免疫熒光顯微鏡下以少免疫復合物沉積為特征，光鏡下多見壞死及新月體腎小球腎炎[20]，患者常常表現為血尿（包括肉眼血尿）、蛋白尿甚至導致不可逆的腎功能衰竭。局灶型預后相對較好，新月體型常常呈現為腎功能急進性下降，但積極治療后腎功能可恢復，混合型病情進展一般介于上述兩者之間，而硬化型預后最差，進展為終末期幾率較前述3 種類型大，確診后第一年內死亡的風險也更高。本研究發現，位點基因型及等位基因在4 種不同病理類型間分布差異有統計學意義，相關性分析發現，相較于等位基因C，突變等位基因T 為新月體型、混合型的危險因素，并未發現與硬化型存在明顯關聯。隱性模型下，突變純合基因型TT 為新月體型、混合型的危險因素。上述結果提示，或許基因多態性會影響血管炎發生發展過程，進而在腎活檢中表現為不同的病理類型，患者臨床表現復雜多樣，針對個體化治療有較大獲益，這也為臨床治療提供了新的思路。

基于上述，中國人群中STAT4 rs3024877 基因多態性與AAV 易感性無關，與腎損害相關病理類型存在關聯，對于臨床治療有一定的指導意義，但由于本實驗樣本量較小，后續需擴大樣本量以進行更深入的研究。鑒于STAT4 在炎癥和自身免疫中的不可或缺性，該基因其他位點或許有望成為AAV的有效治療靶點，期待更多學者擴大研究人群及樣本量，來闡明發病關鍵因子，提高AAV 診治水平。