新型冠狀病毒血清特異性抗體不同方法學檢測分析

王倩，張華，袁玉華

（1.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院檢驗科，天津 300052；2.天津醫(yī)科大學總醫(yī)院空港醫(yī)院檢驗科，天津 300300）

隨著新型冠狀病毒肺炎疫情的發(fā)生和發(fā)展，人們對新型冠狀病毒（SARS-CoV-2）的認識不斷深入，檢測和診療經(jīng)驗在不斷積累，血清學檢測方法在公共衛(wèi)生和臨床應用領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。核酸檢測作為當前新型冠狀病毒感染診斷的金標準，其特異性較高，但其檢測結(jié)果的準確性受采樣部位、樣本質(zhì)量、保存條件以及試劑盒性能等的影響，容易出現(xiàn)假陰性而漏診的情況。血清學抗體檢測通過檢測宿主對該病毒的體液免疫反應而能夠間接檢測出當前或既往感染[1]。血清新型冠狀病毒特異性IgM 抗體和IgG 抗體陽性；血清新型冠狀病毒特異性IgG 抗體由陰性轉(zhuǎn)為陽性或恢復期較急性期有4 倍及以上升高已成為新型冠狀病毒肺炎確診依據(jù)[2]。血清學抗體檢測樣本易于獲得、保存和運輸，其可與核酸檢測協(xié)同進行，并可通過連續(xù)監(jiān)測來判斷病情。目前SARS-CoV-2 抗體IgM 和IgG 檢測已被納入到《新型冠狀病毒肺炎防控方案（第五版）》和《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第七版）》中[2-3]。有研究表明聯(lián)合血清學抗體檢測可以降低核酸檢測的假陰性和假陽性[4]。作為一種輔助方法，血清學抗體檢測可以用來診斷出現(xiàn)癥狀9～14 d后檢測的患者，這個時候鼻咽拭子樣本的核酸檢測敏感度下降，而抗體檢測的敏感度提高，結(jié)合使用兩種檢測手段可以大大增加確診測試的敏感度[5]?，F(xiàn)階段我國已批準上市的SARS-CoV-2 特異性抗體檢測試劑在方法學上主要包括膠體金免疫層析法和化學發(fā)光法，兩者有其各自的優(yōu)勢和局限性，本實驗旨在對這兩種方法學在SARS-CoV-2 特異性抗體檢測中的陽性檢出率進行比較，并簡單比較新型冠狀病毒肺炎確診患者和無癥狀感染者血清學抗體檢測陽性率是否存在差異。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑 A、B、C、D、E 膠體金免疫層析法新型冠狀病毒抗體檢測試劑、F 磁微?；瘜W發(fā)光法抗體檢測試劑。

1.1.2 儀器 Bioscience Axceed 260 全自動化學發(fā)光免疫分析儀，Biobase 二級A2 型生物安全柜。

1.1.3 樣本 2020 年3 月25 日—2020 年5 月7 日天津醫(yī)科大學總醫(yī)院空港醫(yī)院外來入境和隔離點確診患者及無癥狀感染者靜脈血標本，其中10 例為新型冠狀病毒肺炎確診患者，11 例為無癥狀感染者，確診組患者年齡（29.7±12.5）歲，男/女=5/5，發(fā)病時間（42.4±33.9）d；無癥狀感染組年齡（36.7±17.6）歲，男/女=1/10，兩組間年齡差異不存在統(tǒng)計學意義（P＞0.05），本研究中確診病例使用轉(zhuǎn)院前最近一次抗體檢測結(jié)果，無癥狀感染者則使用入院1 周后的第二次抗體檢測結(jié)果（與入院時第一次檢測結(jié)果均存在一致性），所選擇的無癥狀感染者均已排除自身免疫功能異常影響并在后期隨訪中未發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)為確診?？瞻讓φ战M為20 例排除新型冠狀病毒感染者。以《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》[11]中相關(guān)規(guī)定為確診依據(jù)。空白對照組為20 例排除新型冠狀病毒感染者。以《新型冠狀病毒肺炎診療方案（試行第九版）》[11]中相關(guān)規(guī)定為確診依據(jù)。

1.2 實驗方法 樣本處理在二級生物安全柜內(nèi)進行，紫外燈照射下，3 500 r/min，離心5 min，靜置15 min，不同方法樣本操作嚴格按照各試劑廠商說明書進行，相關(guān)生物安全處理及防護均參照《2019新型冠狀病毒肺炎臨床實驗室檢測的生物安全防護指南（試行第一版）》[6]。

1.3 統(tǒng)計學處理 通過公式：陽性率=陽性例數(shù)/總樣本量×100%，計算陽性率，統(tǒng)計分析使用SPSS 21.0 軟件，使用t 檢驗對兩組別年齡進行差異分析，使用Fisher 確切概率法對抗體IgM、IgG 用不同方法檢測的陽性檢出率做差異分析，P＜0.05 為具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 抗體IgM 抗體IgM 使用不同方法學檢測的陽性率見表1、病例檢測結(jié)果見表2、3。確診病例組使用B、C、D、E、F 檢測IgM 抗體的陽性率時差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05），使用Fisher 確切概率法對抗體IgM 用不同方法檢測的陽性檢出率做差異分析發(fā)現(xiàn)，B 與C，B 與D，B 與E，C 與F，D 與F，E 與F 的陽性率差異存在統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表4，圖1。同時比較磁微?；瘜W發(fā)光法與膠體金免疫層析法陽性率發(fā)現(xiàn)，C、D、E 3 種方法與磁微?；瘜W發(fā)光法F 間的陽性率差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05），通過磁微?；瘜W發(fā)光法檢測，可以將確診病例檢測IgM 抗體的陽性率提高80%～90%。無癥狀感染組使用B、C、D、E、F 檢測IgM 抗體的陽性率時差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05），通過兩兩比較發(fā)現(xiàn)，B 與C，B與D，B 與E，C 與F，D 與F，E 與F 的差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表5、圖1。通過磁微?；瘜W發(fā)光法檢測，可以將無癥狀感染組檢測IgM 抗體的陽性率提高90.9%。

表1 不同方法測定抗體IgM 的陽性率（%）Tab 1 IgM positive rate determined by different method（%）

表3 無癥狀感染組IgM 檢測結(jié)果Tab 3 IgM test results in asymptomatic infection group

表2 新型冠狀病毒肺炎組IgM 檢測結(jié)果Tab 2 IgM test results in the COVID-19 group

表4 確診病例組不同方法測定抗體IgM 的陽性率多組間比較[n（%）]Tab 4 Comparison of the positive rate of IgM antibody measured by different methods among confirmed case groups[n（%）]

表5 無癥狀感染組不同方法測定抗體IgM 的陽性率多組間比較[n（%）]Tab 5 Comparison of the positive rate of antibody IgM measured by different methods in asymptomatic infection group among multiple groups[n（%）]

2.2 抗體IgG 抗體IgG 使用不同方法學檢測的陽性率見表6。病例檢測結(jié)果見表7、8。在抗體IgG 檢測中，通過統(tǒng)計學比較發(fā)現(xiàn)確診病例組用C、D、E、F檢測IgG 抗體的陽性率時差異不存在統(tǒng)計學意義（P＞0.05）見表9、圖1；無癥狀感染組用C、D、E、F 檢測IgG 抗體的陽性率時差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05），使用Fisher 確切概率法對抗體IgG 用不同方法檢測的陽性檢出率做差異分析發(fā)現(xiàn)，C 與D，C 與E，F(xiàn) 與D，F(xiàn) 與E 的差異存在統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表10、圖1。通過磁微?；瘜W發(fā)光法檢測，可以將無癥狀感染組檢測IgG 抗體的陽性率提高36.4%～45.5%。另外，A 試劑陽性率為100%，其測定總抗體，不區(qū)分免疫球蛋白類型。

表6 不同方法測定抗體IgG 的陽性率（%）Tab 6 Determination of IgG positive rate by different methods（%）

表7 新型冠狀病毒肺炎組IgG 檢測結(jié)果Tab 7 Results of IgG detection in the COVID-19 group

表8 無癥狀感染組IgG 檢測結(jié)果Tab 8 Results of IgG assay in asymptomatic infection group

表9 確診病例組不同方法測定抗體IgG 的陽性率多組間比較[n（%）]Tab 9 Comparison of the positive rate of antibody IgG measured by different methods among confirmed case groups[n（%）]

表10 無癥狀感染組不同方法測定抗體IgG 的陽性率多組間比較[n（%）]Tab 10 Comparison of the positive rate of antibody IgG measured by different methods in asymptomatic infection group[n（%）]

圖1 多種方法檢測IgM、IgG 及總抗體陽性率分別在確診組和無癥狀感染組中的多組間比較Fig 1 Multigroup comparison of IgM,IgG and total antibody positive rates in the confirmed and asymptomatic infection groups,respectively

3 討論

本文涉及到的陽性患者例數(shù)相對較少，處于疾病的不同階段，抗體IgM、IgG 可能產(chǎn)生滴度較低或產(chǎn)生滴度下降，可能低于試劑的檢測限未被檢出，更有說服力的試劑性能評價有待于積累更多不同階段感染病例標本進一步測定。隨著對新型冠狀病毒認識的不斷加深，標本的復檢流程也需要不斷更新。本研究發(fā)現(xiàn)磁微?；瘜W發(fā)光法相較于膠體金免疫層析法檢測新型冠狀病毒肺炎患者抗體IgM 以及無癥狀感染者抗體IgM 和IgG 具有更的高陽性檢出率，更有利于區(qū)分既往感染和當前感染，但其對檢測條件有較高要求，檢測時間相對較長；膠體金免疫層析法檢測速度快，靈敏度相對磁微?；瘜W發(fā)光法較低，不同醫(yī)療機構(gòu)實驗室應根據(jù)收治患者的具體情況制定符合自身的復檢流程。作為補充篩查手段，新型冠狀病毒抗體檢測需要動態(tài)觀察，必須結(jié)合患者流行病學史、臨床癥狀以及病毒核酸檢測或抗原等病原學檢測進一步確定。

本研究通過比較不同方法學在新型冠狀病毒肺炎確診患者和無癥狀感染者中SARS-CoV-2 特異性抗體的陽性檢出率發(fā)現(xiàn)，在確診組和無癥狀感染組，膠體金免疫層析法對抗體IgM 的陽性檢出率均低于磁微?；瘜W發(fā)光法，在無癥狀感染組，膠體金免疫層析法對抗體IgG 的陽性檢出率低于磁微?；瘜W發(fā)光法。原因可能包括兩方面：一方面，檢測試劑所包被抗原片段的選擇至關(guān)重要，在COVID-19 感染的早期階段，機體產(chǎn)生靶向刺突糖蛋白（S）的IgM 抗體，感染后期產(chǎn)生結(jié)合S、核衣殼磷酸化蛋白（N）和Orf1Ab 蛋白的IgG 抗體[7]。S 蛋白存在于病毒表面對于病毒進入人體必不可少[5]，而N 和Orf1Ab 蛋白通常被隔離在病毒顆粒內(nèi)，隨著病毒在宿主細胞內(nèi)復制，N 和Orf1Ab 蛋白可能會從細胞中釋放出來，并隨后被體液免疫系統(tǒng)識別[8]。被用作抗原靶標的S 蛋白包括多種形式：全長S 蛋白（S1+S2）、S 蛋白胞外域（S1+S2ECD）、S 蛋白亞基1受體結(jié)合域（S1-RBD）等。由于來自不同制造商的膠體金免疫層析法試劑多選用N 蛋白、S 蛋白和（或）S蛋白片段作為靶標[7]，本研究中磁微?；瘜W發(fā)光法F測定IgM 抗體，使用刺突糖蛋白亞基1 受體結(jié)合域（S1-RBD）蛋白為靶標。由于包被抗原片段不同，有研究結(jié)果表明，N 蛋白IgM 抗體不能區(qū)分COVID-19 和其他流感和非流感患者，IgG 抗體對N 蛋白的敏感性也很低，靶向S1-RBD 和S1+S2ECD 的IgM抗體可以最好地鑒別COVID-19 患者和其他流感和非流感患者，而S2ECD 和S1+S2ECD 蛋白可能是IgG 抗體檢測的最佳抗原靶標[9]。在確診患者組，膠體金免疫層析法和磁微粒化學發(fā)光法檢測抗體IgG，其陽性率沒有表現(xiàn)出統(tǒng)計學差異，由于本研究樣本數(shù)量較少，結(jié)果有待于更大批量樣本的驗證。另一方面，膠體金免疫層析法本身在方法學上有其自身的局限性，靈敏度低，相比之下，化學發(fā)光法檢測限低、線性范圍寬，提高了其檢測的靈敏度。美國CDC 指出蛋白靶標決定了血清學檢測的交叉反應性和特異性[5]。在早期SARS-CoV 的研究中[10]已觀察到SARS-CoV 的N 蛋白與已知動物冠狀病毒的多克隆抗血清發(fā)生交叉反應，因此交叉反應的可能性也是一個值得關(guān)注的問題。

同時，隨著人群患病率的不同，抗體檢測需要達到不同陽性預測值。在高患病率的情況下，陽性預測值會增加，而在低患病率環(huán)境中，陰性預測值上升。本研究所涉及的人群均為外來入境申報人員，該人群患病率明顯高于本地區(qū)一般人群，而當前批準上市的抗體檢測試劑，預期用途也被嚴格限定為新型冠狀病毒肺炎患者及高危人群[3]，該試劑適用于該人群，具有一定的可信性。如應用于一般人群篩查，筆者認為應注意選擇高特異性和高陽性預測值的方法以提高檢測結(jié)果的可信性。有指南[5]提出了提高抗體檢測陽性預測值的幾種策略，包括選擇具有足夠高特異性（如95%）的檢測，并檢測高危個體或人群（例如，有與COVID-19 相關(guān)癥狀史的人或接觸過暴發(fā)地區(qū)的人）以及當單次試驗不能保證高陽性預測值時，使用正交試驗算法（Orthogonal testing algorithm），即使用兩種高特異性的不同方法學實驗進行獨立檢測，通過群體概率和貝葉斯定理進行統(tǒng)計學計算以提高陽性預測值。盡管正交測試算法的性能還有待系統(tǒng)的評估，但當前這種方法不失為提高陽性預測值的策略之一。