CPI-203通過抑制p38 MAPK/AKT通路改善類風濕關節炎

林燕雯，張 玲，尹佳璇，潘繼紅,

（1. 山東第一醫科大學 生物醫學科學院暨山東省醫藥生物技術中心生物化學教研室，山東 濟南 250000；2. 山東第一醫科大學第一附屬醫院 類風濕關節炎科，山東 濟南 250000；3. 國家衛健委生物醫藥重點實驗室，山東 濟南 250000；4. 山東省罕見病防治重點實驗室生物化學教研室，山東 濟南 250000）

類風濕關節炎（RA）是一種全身性自身免疫性疾病，導致嚴重的炎癥和骨骼組織的形態變化，包括骨骼和關節損傷、軟骨退化、滑膜增生、成纖維樣滑膜細胞向軟骨和骨表面浸潤、軟骨下骨侵蝕等，這些都是RA的病理標志[1]。全世界每200名成年人中大約1人受累，女性的發病率是男性的2～3 倍。主要發病年齡在50～59歲[1]。RA滑膜成纖維細胞（RASF）已成為RA發病機制中的關鍵參與者，具有轉化細胞的表型和分子特征。RASF能分泌細胞因子、趨化因子和關節損傷酶，從而促成RA的炎癥狀態和關節損傷。RASF具有的凋亡抗性及對巨噬細胞和淋巴細胞等炎癥細胞的招募是RA關節滑膜組織過度增生的主要原因。此外，RASF具有侵襲性和遷移性，可導致疾病傳播到未受影響的關節。

盡管進行了廣泛的研究工作，但RA的病因尚未確定，發病機制復雜。目前的治療方法在控制癥狀方面大多有效，但部分患者仍對多種治療方法，包括抗腫瘤壞死因子α（TNF-α）治療無效。因此，對現有治療方案的醫療需求尚未得到滿足，仍缺乏理想的治療藥物和治療策略。最近研究表明小分子藥物尋找新藥靶可能為RA治療提供新方法[2-4]。

CPI-203是一種強效的BET bromodomain抑制劑，也是一種新型的細胞滲透性小分子藥物，在口服給藥時顯示出良好的生物利用度。已有研究報道表觀遺傳調節蛋白的小分子抑制劑可阻斷與類風濕關節炎相關的致病機制，具有分子量小且毒性低等優點[5-6]。近期小分子藥物通過保護藥物靶點從而發揮治療或緩解疾病研究仍被持續關注[2-4]，然而CPI-203在 RASF中存在的其他潛在藥物靶點仍未可知，有被進一步開發為新的、安全的藥物，以在功能上治愈RA的潛力。

1 儀器與材料

1.1 儀器

Eclipse E100 顯微鏡（日本尼康）；SpectraMax iD3酶標儀（Molecular Devices）；20R低溫高速離心機（德國Backman）；Quantum GX Micro-CT（日本Perkin Elmer）；iCAN細胞培養箱（美國Thermo Scientific）；1384超凈工作臺（Thermo）；Light Cycler 480熒光定量檢測儀（瑞士Roche）；SDS-PAGE電泳儀（美國Bio-Rad公司）；HH-1水浴鍋（常州國華）；ECL Plus檢測系統（美國Thermo Scientific）。

1.2 試劑

DMEM 培養基（美國Gibico）；胎牛血清（美國Gibico）；青霉素鏈霉素雙抗（美國Gibico）；PBS（美國Gibico）；EDTA-胰酶（美國Gibico）；Ⅱ型膠原酶（索萊寶）；Ⅲ型膠原酶（索萊寶）；二甲基亞砜（索萊寶）；IL-1β（Abbkine）；TRIzol（諾唯贊）；RNA反轉錄試劑盒（諾唯贊）；SYBR Mixture（康維公司）；4 %組織細胞固定液（索萊寶）；結晶紫/龍膽紫混合染色液（索萊寶）；小室（BD）；基質膠（Corning）；ELISA試劑盒（聯科生物）；引物（華大基因）；CPI-203（Selleck生物公司）；Bradford蛋白濃度測量試劑盒（碧云天）。

1.3 動物

雄性DBA 1/J小鼠購自北京華阜康生物科技有限公司，8周齡，20～25 g。小鼠飼養于山東第一醫科大學生物醫學科學學院SPF級動物房，符合山東第一醫科大學動物飼養及管理條例。所有動物實驗和流程嚴格按照山東第一醫科大學實驗動物條例進行。

1.4 細胞

從RA患者中收集滑膜組織在膝關節置換手術期間（n=14，男性5例，女性9例，年齡35～75歲，平均年齡53歲）。患者均符合 1987 年美國風濕病學會修訂的類風濕關節炎診斷標準。獲得每位患者的書面知情同意書及委員會批準（批準號：2019-02）。將滑膜組織浸泡在生理鹽水中，使用II型和III型膠原酶消化6～8 h，于37 ℃，含5 % CO2細胞培養箱培養48 h等待成纖維樣細胞貼壁。提取的細胞在含10 % 胎牛血清和1 %雙抗的DMEM完全培養基中進行培養并傳代，傳代至5～7代使用。

1.5 軟件

GraphPad Prism 9軟件包。

2 方法

2.1 RASF細胞增殖-毒性檢測

取4×104個細胞/ml的RASF 9.6 ml接種于96孔板，于細胞孵箱培養12 h，待貼壁后設置分組為空白組、細胞未處理組、DMSO組、CPI-20（0.5，1，2，5 μmol/L）組，每組設4個重復孔，給藥后繼續培養48 h。向每孔加入 10 μl CCK-8溶液，孵育 1 h后用酶標儀測定450 nm處吸光度。計算細胞增殖率和半數抑制濃度。增殖率（%）=（加藥孔OD值-空白孔OD值）/（未加藥孔OD值-空白孔OD值）×100。

2.2 RASF侵襲、遷移、血管形成數測算

2.2.1 實驗分組及處理 取5.6×105個細胞/ml的RASF 4 ml，接種于12孔板，設置分組為正常對照組、IL-1β（10 ng/ml）誘導組、CPI-203（1 μmol/L）用藥組（有或無IL-1β 誘導），用藥組以1 μmol/L CPI-203處理24 h，IL-1β 刺激 12 h，每組設3個重復孔。

2.2.2 RASF侵襲數測算 在Transwell上室每個室中加入100 μl稀釋后的基質膠，于細胞孵箱中靜置1 h。RASF按2.2.1項下方法處理后，按4×104個細胞/ml接種于Transwell上室（其中加入含2 % 胎牛血清的DMEM完全培養基），待細胞貼壁后，在下室添加含15 % 胎牛血清的完全培養基。繼續培養過夜后，將侵襲到下表面的細胞進行染色并計數，每個分組包括3個重復視圖，并計算侵襲細胞的平均數量。

2.2.3 RASF遷移數測算 按2.2.1項下方法進行實驗分組和細胞處理，用無血清無抗生素的培養基換液并進行劃痕，拍攝0 h和12 h細胞遷移圖片并使用 Image-J計算培養0 h和12 h細胞劃痕面積。創傷愈合率（%）=（12 h細胞劃痕面積-0 h細胞劃痕面積）/0 h細胞劃痕面積×100。

2.2.4 體外血管形成能力評估 按2.2.1項下方法進行實驗分組和細胞處理，用無血無抗培養基按1:3比例稀釋基質膠，于48孔板鋪稀釋好基質膠50 μl，置于37 ℃孵箱靜止1 h后，分別取各處理組細胞上清，按每孔105個細胞重懸后，加入鋪好基質膠的培養板，于孵箱繼續培養4 h后鏡下觀察拍攝成管情況，使用Image-J計算管形成數。

2.3 RASF中IL-6、IL-8、MMP-1/3、TIMP-3、VEGF mRNA的檢測

采用qRT-PCR方法。取5.6×105個/ml的RASF 4 ml，接種于12孔板，設置分組為正常對照組、IL-1β（10 ng/ml）誘導組、CPI-203（1 μmol/L）用藥組（有或無IL-1β誘導），用藥組以1 μmol/L CPI-203處理24 h，IL-1β刺激12 h，每組設3個重復孔。按試劑盒使用說明書，使用TRIzol試劑從培養的細胞中提取總RNA，再經逆轉錄成cDNA。使用Light Cycler 480進行qRT-PCR。實驗重復3 次，采用2-ΔΔCt方法計算目的基因相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列

2.4 RASF上清中IL-6、IL-8、MMP-1、MMP-3、TIMP-3水平的檢測

采用ELISA法。取5.6×105個/ml的RASF 4 ml接種于12孔板，設置分組為正常對照組、IL-1β（10 ng/ml）誘導組、CPI-203（1 μmol/L）用藥組（有或無IL-1β誘導），用藥組以1 μmol/L CPI-203處理24 h，IL-1β刺激12 h，每組設3個重復孔。培養36 h后，收集上清，用ELISA試劑盒檢測IL-6、IL-8、MMP-1、MMP-3、TIMP-3分泌水平。

2.5 RASF中p-p38、p-AKT表達水平的檢測

采用Western blot法。取8.8×105個細胞/ml的RASF4 ml接種于6孔板，設置分組為正常對照組、IL-1β（10 ng/ml）誘導組、CPI-203（1 μmol/L）用藥組（有或無IL-1β誘導），用藥組以1 μmol/L CPI-203處理24 h，IL-1β刺激12 h，每組設3個重復孔。培養48 h后，收集細胞提取蛋白，用Bradford蛋白濃度測量試劑盒檢測蛋白濃度。經100 ℃，7 min變性后進行聚丙烯酰胺凝膠（SDS-PAGE）電泳，并將蛋白轉至硝酸纖維素膜，用5 %脫脂奶粉封閉1 h ，再用p-p38、p-AKT、p-38、AKT和β-tubulin 抗體過夜孵育，Tris-HCl 緩沖鹽溶液+Tween 20 （TBST）洗3遍后與二抗共孵育1.5 h。再用TBST洗3遍后使用ECL Plus檢測系統進行檢測。

2.6 CIA小鼠模型構建

2.6.1 模型構建 DBA 1/J雄性小鼠尾根部注射2 mg/ml牛II型膠原和完全弗氏佐劑1:1乳化劑200 μl，后正常飼養，21 d后小鼠尾根部二次免疫注射牛II型膠原和不完全弗氏佐劑1:1乳化劑200 μl。每天對小鼠進行一次關節炎癥狀監測，待鼠爪腫脹完全，提示CIA模型建立成功。

2.6.2 分組及給藥 將18只DBA 1/J雄性小鼠隨機均分為正常對照組、誘導組、CPI-203用藥組。CPI-203用藥組構建CIA模型后，第一次注射膠原和弗氏完全佐劑混合乳化劑后第 50 天即小鼠關節炎發病高峰時，腹腔注射CPI-203 30 d（200 mg/kg），每兩天注射1次，觀察并記錄小鼠鼠爪炎癥緩解情況。正常對照組不構建CIA模型。誘導組構建CIA模型后，腹腔注射等量DMSO。

2.7 小鼠血清中炎性因子水平測定

CPI-203治療30 d后，取小鼠血清，離心去除微粒后，按ELISA試劑盒操作步驟檢測血清中IL-6、IL-8水平。

2.8 Micro-CT 成像和蘇木精-伊紅（HE）染色

對鼠爪進行Micro-CT掃描，并對掃描結果進行二次重建分析小鼠骨關節的微觀結構。后將鼠爪在10 %組織固定液中固定24 h，并在15 %乙二胺四乙酸（EDTA）中脫鈣。然后將鼠爪包埋于石蠟中，并從鼠爪矢狀面以5 μm厚度連續切片，切片用HE染色。

2.9 統計學方法

使用GraphPad Prism 9軟件包對數據進行統計。數據符合正態分布，檢驗采用Shapiro-Wilk方法，符合正態分布的計量資料以±s表示，兩組均值比較采用t檢驗，多組間均值比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA）。檢驗水準=0.05（雙側），P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 CPI-203抑制RASF增殖

用藥組細胞增殖率隨藥物濃度增加而減少，表明CPI-203對細胞增殖有較好的抑制作用，且作用呈濃度依賴性。CPI-203的IC50值為1.18±0.19 μmol/L，確定后續給藥濃度為 1 μmol/L。

3.2 CPI-203降低IL-1β誘導的RASF侵襲、遷移、血管形成數

正常對照組、I L-1 β 誘導組、C P I-2 0 3（1 μmol/L）用藥組、CPI-203+IL-1β組細胞侵襲數目分別為（84.60±2.966），（63.80±1.643），（134.6±3.362），（75.60±4.393）個。與正常對照組相比，IL-1β誘導組侵襲細胞數目增多（P＜0.001）；且CPI-203可降低IL-1β誘導的RASF侵襲數目增多（P＜0.001），見圖1A。各組遷移細胞創傷愈合結果見圖1B。與IL-1β誘導組比較，CPI-203+IL-1β組細胞的遷移能力下降（P＜0.001）。正常對照組血管形成數為（82.67±8.021），IL-1β誘導組血管形成數為（171.3±3.05），CPI-203（1 μmol/L）用藥組血管形成數為（53.67±12.86），CPI-203+IL-1β組血管形成數為（133.7±10.07）。與IL-1β誘導組相比，CPI-203+IL-1β組血管形成數減少（P＜0.005），見圖1C。

圖1 CPI-203對RASF侵襲（A）、遷移（B）、血管形成數（C）的影響（n=3）

3.3 CPI-203作用后逆轉IL-1β誘導的IL-6、IL-8、MMP-1/3、CCL-2、VEGF的mRNA表達及TIMP-1/3的抑制

與正常對照組相比，CPI-203對RASF中炎癥介質因子IL-6、IL-8、MMP-1/3、VEGF的表達具有顯著抑制作用（P均＜0.03），同時誘導了TIMP-1/3的表達（P＜0.0007）。不同處理組 IL-6、IL-8、MMP-1/3、TIMP-1/3、CCL-2、VEGF表達水平見圖2。

3.4 CPI-203作用后RASF上清中IL-6、IL-8、MMP-1/3、TIMP-3的分泌水平變化

結果見圖3。由圖3可見，CPI-203降低IL-1β誘導的IL-6、IL-8、MMP-1/3表達（P均＜0.001），同時逆轉IL-1β誘導的TIMP-3的抑制（P＜0.001）。

3.5 CPI-203對CIA模型小鼠關節炎發生發展的影響

結果見圖4。由圖4可見，與DMSO處理的小鼠相比，CPI-203處理的小鼠表現出明顯改善，關節炎評分明顯降低。鼠爪厚度和腫脹程度、受累關節的組織學及影像學分析顯示滑膜增生、軟骨降解和骨破壞減少。與陽性對照組相比，實驗組小鼠血清IL-6、IL-8蛋白水平降低（P＜0.001），差異有高度統計學意義。以上結果表明，CPI-203可改善CIA小鼠關節炎的發生發展。

圖4 CPI-203對CIA小鼠關節炎的影響（n=6）

3.6 CPI-203對IL-1β誘導的MAPK、AKT通路的影響

p38 MAPK及AKT通路激活后轉錄因子p-p38和p-akt在炎癥方面發揮重要作用。Western blot結果顯示CPI-203顯著抑制IL-1β誘導的p-p38和p-akt磷酸化水平，表明CPI-203對炎癥具有抑制作用，這與細胞及小鼠血清中炎癥因子水平變化的結果一致。

圖5 CPI-203 對 MAPK、AKT 通路的影響（n=3）

4 討論與結論

本研究發現CPI-203可抑制RASF的炎癥、基質降解、增殖和趨化因子表達，表明在RA中CPI-203的治療潛力。體外研究結果表明，CPI-203可在體外抑制RA的促炎因子表達、侵襲、遷移和血管生成行為。體內研究表明，經CPI-203治療的小鼠的關節腫脹、炎癥和滑膜增生、骨侵蝕及骨降解明顯少于未治療的陽性對照組動物。

本項研究仍有一些局限性。文中僅分析了CPI-203治療過程中MAPK和AKT信號通路的變化。推測可能有其他重要通路可調節這一過程。因此，計劃在未來使用高通量測序等方法研究其他潛在的關鍵通路和藥物靶點，以冀為小分子抑制劑的發展和應用做出貢獻。