基于PI3K/Akt/mTOR信號通路的苦參堿誘導人乳腺癌MCF-7細胞自噬及其機制的研究

賈紹華，丁海鑫，孫萌遙，金詩鵬

（哈爾濱商業大學 藥學院（藥物工程技術研究中心），黑龍江 哈爾濱 150076）

細胞自噬是程序性細胞死亡（PCD）類型之一，與細胞凋亡不同，它是哺乳動物真核細胞在自噬相關基因（ATG）的調控下，通過細胞骨架的運輸和溶酶體內的水解酶，降解細胞內衰老蛋白和受損細胞器的過程，又被稱為II型程序性細胞死亡[1]。在營養不足、缺氧、氧化應激、內質網應激、代謝條件應激等多種狀態下都可通過細胞自噬來提高細胞對生物大分子的回收能力，從而使細胞能在壓力狀態下也存活[2]。P13K/Akt/mTOR信號在腫瘤細胞中廣泛存在，在控制細胞的生長、增殖、代謝等過程中起著重要作用[3]。

苦參堿（matrine）是由豆科植物苦參的干燥根、植株等部位經乙醇等有機溶劑提取制成的一種生物堿，具有抗菌、抗病毒、抗炎、調節免疫、調節心腦血管疾病、抗腫瘤等多種藥理活性[4-5]。研究發現苦參堿能有效治療肝癌[6]、胃癌[7]、前列腺癌[8]、乳腺癌[9-10]等多種癌癥，其可通過抑制腫瘤細胞增殖和轉移，誘導腫瘤細胞凋亡等多種途徑來發揮抗腫瘤作用[11]。本文通過苦參堿對MCF-7細胞自噬及其P13K/Akt/mTOR信號通路的研究，從自噬的角度進一步揭示其抗腫瘤作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器

ECO-170P-230培養箱（美國NBS公司）；CKX-41-32型倒置顯微鏡（日本OLYMPUS公司）；Adventurer萬分之一電子天平（美國Ohous公司）；DK-8D型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學有限公司）；DL-CJ-1N醫用型超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）；680型全自動酶標儀（美國BIO-RAD公司）；DL-CJ-1N醫用超凈工作臺（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）；Image Quant LAS 500凝膠成像系統（GE公司）；DYCZ-24N型垂直電泳儀（北京六一儀器廠）；DYCZ-40D型電泳轉印槽（北京六一儀器廠）；硝酸纖維素（NC）膜（美國PALL公司）； DMI3000B熒光顯微鏡（德國Leica公司）；日立H8650透射電鏡（日本日立高新技術公司）；細胞培養板（美國康寧公司）。

1.2 藥品與試劑

苦參堿（含量≥98 %，批號：A0094，規格：20 mg，成都曼思特；RPMI1640溶液（大連美侖）；胎牛血清（批號：2017412，杭州四季青）；鹽酸表阿霉素（批號：17110102，哈爾濱三聯藥業）；溴化四氮唑藍（MTT，批號：20170512，天津阿爾法）；Bradford蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0006，碧云天）；特超敏ECL化學發光試劑盒（批號：MA0186，大連美侖）；兔抗β-actin多克隆抗體（批號：bs-0061R，博奧森生物技術有限公司）；辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG（H+L）（批號：A0208，碧云天）；兔抗LC3多克隆抗體（批號：bs-8878R，博奧森）；兔抗AKT多克隆抗體（批號：AA326，碧云天）；兔抗Phospho-AKT（Ser473）多克隆抗體（批號：AA329，碧云天）；兔抗PI3Kinase p110α/PIK3CA 多克隆抗體（批號：AF7749，碧云天）；兔抗Phospho-PI3K多克隆抗體（批號：AF5905，碧云天）；兔抗mTOR多克隆抗體（批號：AF1648，碧云天）；兔抗PhosphomTOR多克隆抗體（批號：AF5869，碧云天）；4 %多聚甲醛固定液（批號：BL539A，天津阿爾法）；自噬雙標腺病毒（mRFP-GFP-LC3，批號：AD21042301，上海漢恒）；2.5 %戊二醛溶液（批號：A00151，天津阿爾法）。

1.3 細胞株

人乳腺癌MCF-7細胞株，由哈爾濱商業大學藥學院（藥物工程技術研究中心）提供。

2 方法

2.1 細胞培養

人乳腺癌MCF-7細胞復蘇后，用含10 %胎牛血清的RPMI-1640培養基于37 ℃、5% CO2培養箱中培養。當細胞密度達到80 %～90 %且細胞狀態良好時，用0.25 %胰蛋白酶消化并吹打成細胞懸液進行傳代培養。

2.2 自噬雙標腺病毒（mRFP-GFP-LC3）法檢測苦參堿對MCF-7細胞自噬的影響

取處生長狀態良好的MCF-7細胞，棄掉培養基，再加入PBS清洗，加入胰酶進行消化，消化完全后加入3 ml培基，用移液槍將細胞吹打成單細胞懸液，分別在6孔板中每孔加入1.5 ml細胞懸液，放入培養箱中繼續培養，待細胞完全貼壁，空白對照組加入1.5 ml 1640溶液，陽性對照組加入0.4 μg/ml鹽酸表阿霉素溶液作為陽性對照，給藥組分別加入0.4，0.8，1.2 mg/ml苦參堿溶液，給藥后繼續放入培養箱培養24 h。取出6孔板，每孔加入10 μl自噬雙標腺病毒（mRFP-GFP-LC3），放入培養箱繼續培養24 h，24 h后將6孔板取出，PBS清洗3次，每次5 min，每孔加入多聚甲醛固定20 min后，PBS清洗3次，每次5 min，再用PBS清洗，熒光顯微鏡觀察，整個實驗過程中注意避光。

2.3 透射電鏡（TEM）法觀察苦參堿給藥后MCF-7細胞的形態變化

取生長狀態良好的細胞，傳代后放入培養箱培養24 h，待細胞貼壁后進行給藥，空白對照組加入無血清的1640培養基，陽性對照組加入濃度為0.4 μg/ml的鹽酸表阿霉素溶液，給藥組加入0.8 mg/ml苦參堿溶液，48 h后，用細胞刮將貼壁細胞刮下，1500 r/min離心5 min，待細胞成為細胞團后，加入1.5 ml戊二醛固定液，固定，低溫切片機切片，TEM下觀察細胞形態。

2.4 Western blot法檢測細胞中相關蛋白的表達

將細胞培養瓶從培養箱中取出，待觀察到細胞完全貼壁且生長密度超過80 %，傳代，將新培養瓶置于37 ℃、5% CO2培養箱中進行培養24 h，分別加入最終濃度為0.4，0.8，1.2 mg/ml的苦參堿，陽性對照組加入終濃度為0.4 μg/ml的鹽酸表阿霉素（EPI），陰性對照組加入含10 %胎牛血清的1640培養基，繼續培養48 h。用細胞刮將貼壁細胞從細胞培養瓶中刮下，直至貼壁細胞面變得透明。再將懸液收集至EP管中，1500 r/min離心5 min，棄上清，每管加入PBS1 ml，吹勻，將懸液轉移至1.5 ml EP管中，1500 r/min離心5 min，再次棄去上清，每管中加入蛋白質裂解液100 μl。吹打混勻，-80 ℃保存備用。按Bradford蛋白濃度測定試劑盒說明書操作，加入5×蛋白稀釋液將蛋白濃度調平，每管中加入1/4體積的5×蛋白上樣緩沖液配制成電泳上樣所需樣品，沸水水浴10 min，-20 ℃保存使用。選擇12 %的分離膠、10 %的濃縮膠，恒壓80 V/120 V，直至條帶跑至近下側邊緣，停止電泳。打開膠板，根據目標蛋白質分子量切去多余的凝膠，將NC膜做好標記，按黑色夾板、多孔墊片、三層濾紙、凝膠、NC膜、三層濾紙、多孔墊片、白色夾板的順序放置于電轉液中，將電轉儀置于4 ℃冰箱中，恒流200 mA，電泳1.5 h左右。將轉膜完成后的NC膜置于5 % 脫脂奶粉溶液中，室溫，封閉2 h。將封閉后的NC膜置于密封袋中，加入稀釋好的一抗，用壓膜機封口，平放在4 ℃冰箱里孵育過夜，第二天將NC膜取出，TBST清洗3次，每次15 min，然后加入二抗，室溫孵育2 h，TBST清洗3次，每次15 min。加ELC，避光，將膜平放在Image Quant LAS 500凝膠成像系統中，用Image pro plus 6.0測定條帶灰度值，以各組待測蛋白條帶灰度值和內參蛋白灰度值比值計算蛋白的相對表達。

2.5 統計學處理

采用SPSS 21.0軟件對實驗數據進行統計學處理，各組實驗數據均值采用均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 苦參堿對MCF-7細胞自噬的影響

結果見圖1、圖2。由圖1可見，陽性對照組、中劑量組和高劑量組與空白對照組自噬水平差異具有高度統計學意義（P＜0.01），EPI組的細胞自噬現象明顯，出現了明顯的溶酶體與自噬小體融合成為自噬溶酶體的生物學過程，苦參堿各劑量組隨著給藥濃度的升高，細胞的自噬率呈明顯上升并伴隨著自噬溶酶體的出現，提示苦參堿能誘導MCF-7細胞自噬。

圖1 苦參堿對MCF-7細胞自噬率的影響

TEM觀察結果見圖2。由圖2可見，陰性對照組MCF-7細胞形態正常；1.0，0.4 μg/ml EPI處理MCF-7細胞48 h后，細胞質內出現豐富的自噬空泡，表明苦參堿可升高細胞自噬的水平。

圖2 苦參堿對MCF-7細胞形態的影響

3.2 苦參堿對PI3K/Akt/mTOR信號通路相關蛋白表達的影響

不同濃度的苦參堿作用于人乳腺癌MCF-7細胞后，Western Blot法檢測相關蛋白的表達情況，結果見圖3。與陰性對照組相比，微管相關蛋白輕鏈II/I（LC3-Ⅱ/LC3-I）的比值隨著苦參堿給藥濃度的增加而變大；Bcl-2同源結構域蛋白（Beclin-1）的表達量呈上升趨勢；磷脂酰肌醇三羥基激酶（PI3K）、蛋白激酶B（Akt）、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR）相對表達量在各組間差異不具有統計學意義（P＞0.05），磷酸化磷脂酰肌醇三羥基激酶（p-PI3K）、磷酸化蛋白激酶B（p-Akt）、磷酸化雷帕霉素靶蛋白（p-mTOR）的表達量明顯降低，與陰性對照組相比，差異具有統計學意義（P＜0.05）。以上結果表明苦參堿能上調人乳腺癌MCF-7細胞自噬水平，其機制可能與PI3K/Akt/mTOR信號通路相關。

圖3 苦參堿對MCF-7細胞中PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、mTOR、p-mTOR、LC3-I、LC3-II、Beclin-1蛋白表達的影響

4 討論

細胞自噬是廣泛存在于真核細胞中的基本生命進程，近年國內外大量研究發現，腫瘤細胞自噬活性高出正常水平數倍，并從多個方面影響惡性腫瘤的發生和預后過程[12-13]。其可分為組成型和適應型，組成型多作用于去除受損或衰老細胞器并維持基礎能量代謝，而適應型則作用于營養缺乏時，動員細胞內的營養物質以滿足能量需求[14]，其生理功能包括降解自身受損、變性、衰老的蛋白質類大分子物質及受損的細胞器，調節免疫功能或延長細胞壽命等。

與自噬相關的基因在進化上都非常保守，被命名為ATG基因。到目前為止，已有40余種ATG基因，其中15個核心基因與哺乳動物的ATG具有保守的一致性[15]。其中Beclin-1是哺乳動物ATG6的同源基因，其與ATG14蛋白結合，參與自噬泡的形成與延伸，在調節自噬細胞雙層膜的形成中起著重要作用；在自噬啟動過程中，ATG5-12-16復合體與ATG8（LC3）-I結合到自噬體內膜與自噬體外膜上，轉變為LC3-II，以脂質的形態存在。自噬小體形成后，除了部分LC3-II仍與內皮細胞結合外，其他主要ATG蛋白都重新進入細胞漿， LC3-II則全部留在成熟的自噬小體上，在自噬小體與溶酶體徹底融合為自噬溶酶體后降解，這種特征一般可用于監測自噬過程[16]，故Beclin-1和LC3都被廣泛認同為自噬的相關標志性蛋白。本研究中，通過Western blot檢測發現自噬標志性蛋白LC3-II/LC3-I、Beclin-1的表達量均呈上升趨勢，表明給藥后MCF-7細胞內有自噬現象的發生；與此同時mRFP-GFP-LC3法和TEM法觀察發現了明顯的溶酶體與自噬小體融合為自噬溶酶體及豐富的自噬空泡的生物學過程，這些結果都強有力地證明了苦參堿可誘導人乳腺癌MCF-7細胞中自噬現象的發生。另外Western-blot法檢測到MCF-7細胞內p-PI3K、p-AKT、p-mTOR的表達量均呈下降趨勢，進一步揭示了苦參堿可能通過降低PI3K/AKT/mTOR通路相關蛋白的磷酸化使MCF-7細胞自噬水平上升。

總之，細胞自噬在健康細胞中發揮著維持穩態功能的重要作用[17]，且其在體內也有預防癌癥發展的作用。有研究發現自噬的存在也降低了DNA的損傷和腫瘤形成的可能性[18]。與此相一致的是，自噬基因敲除的小鼠體內胰腺癌病變的發生率上升[19-20]。盡管如此，自噬也可能在某些疾病中適應良好[21]，如腫瘤細胞在饑餓狀態下可通過自噬激活來維持生存，使其在營養枯竭的微環境中得以生存和增殖[22]，因此細胞自噬對于腫瘤細胞究竟是利還是弊，以及其與細胞凋亡究竟存在何種聯系，仍需進一步研究。