噬菌體清除沙門氏菌生物被膜應用研究進展

郝柳杭，謝自強，宋瑞銘，尹鼎澤，李 悅，黃洋鈴，張占麗，張永英*

（ 1. 河北工程大學生命科學與食品工程學院，河北 邯鄲 056000 ；2. 西北農林科技大學，陜西 楊凌 712100 ； 3. 館陶縣農業農村局，河北 邯鄲 056000 ）

沙門氏菌在自然界中廣泛分布，是一種常見的食源性致病菌。沙門氏菌不僅以感染畜禽作為傳染源，通過水平傳播和垂直傳播兩種方式在動物間傳播，還可通過食品等途徑感染人，從而引起食源性疾病[1]。自然界中，沙門氏菌大多以生物被膜形式存在，附著于飲水設備、醫療設備、食品加工設備等載體表面，約80%的慢性感染均與生物被膜的形成有關[2]。由此可見，沙門氏菌生物被膜是造成公共衛生安全事件的主要因素之一。生物被膜結構復雜，細菌細胞被自身產生的胞外聚合物（EPS）包圍。EPS結構不僅增強了其抵抗吞噬細胞、殺傷細胞的能力，也妨礙了細菌與抗菌藥物和細菌菌團的接觸，導致細菌耐藥性產生。與浮游態沙門氏菌相比，生物被膜形態沙門氏菌更難清除[3]。因此，研究新型安全無污染生物被膜的清除劑刻不容緩。在禁抗背景下，噬菌體因具有抗菌作用而受到了廣泛關注。噬菌體侵染宿主菌時，自身編碼的解聚酶和溶素可降解多糖和肽聚糖，破壞EPS結構，裂解生物被膜。同時，解聚酶還可降解細菌細胞壁上的多糖化合物，破壞細胞壁結構，幫助噬菌體與宿主菌結合，更好地裂解宿主菌[4]。本文總結了沙門氏菌生物被膜、噬菌體的研究進展，總結噬菌體裂解細菌生物被膜的作用機制及相關應用，以期為噬菌體在沙門氏菌臨床防控中的進一步應用提供參考。

1 沙門氏菌生物被膜的相關研究進展

1.1 沙門氏菌生物被膜形成

自然界中，沙門氏菌大多以生物被膜（biofilm）的形式存在。生物被膜是由微生物的細胞及其分泌的聚合物（extracellular polymeric substances，EPS）所組成的多細胞復合體，在微生物的生長過程中附著于載體的表面而形成[5]。生物被膜的形成極大地提高了沙門氏菌在自然環境中的生存能力[3]。EPS對生物被膜的穩定性具有很大的影響，其主要組成成分為多糖和肽聚糖[6]。此外，載體材料、胞外多糖、胞外蛋白、胞外DNA（extracellular DNA，eDNA）在生物被膜形成過程中也發揮了很大的作用，是維持生物被膜穩定性的重要組成部分。生物被膜形成和發展過程可分為5 個階段：黏附、定植、發育、成熟、主動擴散[7]。不同階段的細菌具有不同的特點，黏附期細菌為可逆地吸附到物體表面，但當細菌到達定植期時，吸附作用轉變為不可逆，而后逐漸產生更難清除的EPS結構和三維結構[8]。

1.2 沙門氏菌生物被膜形成的影響因素

生物被膜的形成因子可分為與細胞表面相關和胞外分泌兩大類，其中與細胞表面相關的因子包括鞭毛、菌毛、功能性蛋白質等；與胞外分泌相關的包括胞外多糖、蛋白質、eDNA、eRNA 等[7]。不同組分在生物被膜形成過程中起到不同作用，以下主要介紹5種組分的作用。

（1）鞭毛：在生物被膜形成的初始階段，需要依靠鞭毛的運動性[9]。生物被膜形成過程中的鞭毛功能可在兩個階段進行調節：在組裝階段可通過一系列轉錄調節因子進行調節；在組裝后階段可通過效應蛋白和運動蛋白之間的相互作用進行調節[10]。鞭毛存在于生物被膜形成的各個階段，并在生物被膜的結構中形成類似支架的結構，比缺乏鞭毛的生物被膜結構更難清除[11]。

（2）菌毛（fimbriae）：腸桿菌科中的Ⅰ型菌毛（fimACDH基因簇）和Ⅲ型菌毛（mrkABCD基因簇）在細菌生理學中起到多種作用，包括附著、侵襲、細胞運動以及生物被膜形成[12]。Guo等[13]在123株大腸桿菌強陽性菌株中檢測到49.59%菌株含有mrkABCD基因簇，14.64%菌株含有fimACDH基因簇；而將強陽性菌株中的mrkABCDF和fimACDH基因簇克隆并導入中等陽性菌株質粒載體內，最終中等陽性菌株均轉變為強陽性菌株。

（3）胞外多糖：胞外多糖是EPS的主要組成成分，對生物被膜形成具有重要影響[14]。胞外多糖有助于生物被膜附著于載體表面，幫助鈣鎂離子結合，使生物被膜結構更加緊密，抵御抗菌劑滲透[15-16]。一些清除生物被膜的酶制劑也是依靠溶解生物被膜EPS 中的多糖骨架清除生物被膜[17]。

（4）蛋白質：外膜蛋白（outer membrane protein，OmpS）不僅是細菌重要的毒力因子，對細菌的黏附、侵襲、生物被膜形成、生物被膜結構的穩定也具有重要作用[18]。外膜蛋白的β-桶狀蛋白結構使其在生物被膜中具有極高的穩定性，使生物被膜能夠抵抗惡劣環境[19]。

（5）eDNA：eDNA 結構主要由DNA 結合蛋白家族（DNABII）中整合宿主因子（integrated host factor，IHF）和組蛋白樣蛋白（histone-like protein，HP）維持[20]。這些蛋白質在細胞外是穩定eDNA交叉鏈結構的關鍵蛋白，而穩定的eDNA 結構在生物被膜EPS 結構中類似霍利迪連接（Holliday junctions），增強了生物被膜穩定性[21]。Rocco等[22]用特異性抗體靶向去除DNABⅡ蛋白后，發現生物被膜清除效果明顯。Buzzo 等[23]研究表明，eDNA 為罕見的Z 型DNA，隨著生物被膜的生長而積累，并在積累過程中完善生物被膜結構的完整性，促進生物被膜形成。

1.3 沙門氏菌生物被膜的危害

以生物被膜形態存在的細菌可黏附于各種載體表面，而當微生物所處環境發生變化時，生物被膜內細菌可由一個微菌落轉移到另一個細菌中，從而脫離生物被膜進行擴散。由于生物被膜的形成是動態過程，且各細菌的發展位于不同的時間和空間，所以其生理活性和基因表達具有不均質性[8]，并使生物被膜具有復雜的結構和代謝方式[24]。此外，生物被膜的不均質性導致生物被膜亞群之間具有生理性的異質性，與浮游細胞相比，生物被膜結構更難清除，也更具有抗性[5]。Wang等[25]研究表明，與浮游形態中存在的沙門氏菌相比，以生物被膜形式存在的沙門氏菌對抗菌劑的敏感性更低。細菌形成生物被膜后，由于外部黏性基質的保護，殺菌藥物僅能殺死生物被膜表層細菌和浮游細菌，因此其抵抗吞噬細胞、殺傷細胞等的能力大大提高。同時生物被膜活性較低、生長較慢的特性促進了抗生素耐藥基因交換，更易誘導細菌產生抗生素耐藥性[26]。沙門氏菌生物被膜形成對于沙門氏菌的生存具有重要作用。

1.4 傳統生物被膜的清除方法

生物被膜的清除方法已成為當下研究的一大熱點，常見的有物理方法和化學方法和微生態制劑法。

生物被膜很容易黏附于醫療器械、生物管腔、器官表面等，且難以清除。孫惠惠等[27]研究內鏡硬式管腔生物被膜清除方法時，利用40 kHz 超聲波清洗內鏡管腔，銅綠假單胞桿菌清除率達99%。Carmen等[28]研究表明，超聲波促進了慶大霉素導入大腸桿菌生物被膜。生物被膜外部黏性基質阻礙了抗菌藥物的導入，但是超聲波可促進抗生素導入，提高了抗菌藥物對于生物被膜的清除效果。超聲波法對生物被膜具有良好的清除作用，但與儀器管腔不同，養殖場常見飲水管道長，且常位于地底或墻內等位置，不易于超聲波清除生物被膜。

抗生素、消毒劑等是常見的清除生物被膜的方法[29]。養殖人員會施用沙門氏菌敏感抗生素或消毒劑清除沙門氏菌生物被膜[30]，但由于生物被膜外部黏性基質對生物被膜的保護作用可阻礙抗菌藥物導入，抗生素或消毒劑往往只能作用于生物被膜表層細菌，不能破壞生物被膜的EPS結構，無法清除生物被膜[31]。

益生元和抗菌肽等是常見的防控沙門氏菌的生物制劑，可有效防止沙門氏菌定植，避免生物被膜形成，但二者發揮效用的條件比較苛刻，制造成本較高，不適用于環境中生物被膜的防控與清除[32-33]。

隨著沙門氏菌耐藥問題日益嚴重，尋找一個新型、有效、安全、方便的抑制生物被膜形成和裂解沙門氏菌生物被膜的方法具有重要的現實意義。

2 噬菌體及其裂解生物被膜的作用

2.1 噬菌體的特性及應用進展

噬菌體是一種特殊的細菌“病毒”，可將宿主菌裂解。自然界中，有細菌生存的地方就有噬菌體的存在，數量十分龐大。噬菌體可分為裂解性噬菌體和溫和性噬菌體，裂解性噬菌體可特異性地感染某些細菌，并將其裂解；溫和性噬菌體也稱作溶原性噬菌體，是將自身DNA 與宿主菌的DNA 整合，使其與宿主菌的DNA 一同復制，這個過程也可稱作“溶原轉換”[34]。噬菌體具有較高的溫度耐受力和較強的耐酸性，且尚未發現噬菌體會對生物機體產生明顯毒性，因而對噬菌體藥物的研究具有可行性[35]。

1921年，學界第一次報道了人類疾病治療中應用噬菌體[36]。但由于抗生素的發展與使用，噬菌體的研究被慢慢擱置。近年來，日益嚴重的耐藥性問題使得噬菌體療法重新被人們重視，許多研究人員開始利用噬菌體治療細菌疾病。目前，噬菌體療法主要分為全噬菌體療法與裂解酶制劑療法兩個方向[37]。噬菌體療法還應用于沙門氏菌、大腸桿菌、彎曲桿菌等多種細菌性疾病的治療中[38-40]。

2.2 噬菌體裂解細菌生物被膜機制

噬菌體復制需要依賴宿主細菌，當噬菌體侵染細菌時，自身編碼多種酶，損害細菌的屏障。雖然噬菌體可能受到EPS基質的影響，但其編碼的解聚酶和溶素可降解多糖和肽聚糖，從而破壞EPS結構，協助噬菌體傳播，裂解細菌生物被膜[6]，因此噬菌體仍然能夠在生物被膜內傳播和復制，避免生物被膜的抗吞噬性，從而更好地殺滅細菌[41]。當增殖周期結束時，噬菌體會在宿主細胞內合成內溶素，直接靶向細菌細胞壁的肽聚糖（peptidoglycan，PG）中的鍵，特異性地裂解細菌[42]；解聚酶還可識別、結合、降解細菌細胞壁上的多糖化合物，破壞細菌細胞壁結構，暴露受體，使噬菌體更易與宿主菌結合[43]。

2.3 噬菌體裂解細菌生物被膜的應用

2.3.1 噬菌體裂解細菌生物被膜在外部環境中的應用

生物被膜具有黏附特性，在飼料儲存場所、飼料傳送帶、飲水管道等多處飼料飲水可接觸表面可以檢出沙門氏菌。Korzeniowski 等[44]在試驗中利用噬菌體清除96 孔板和不銹鋼表面的沙門氏菌生物被膜，結果發現清除率分別為32%～69%和52%～98%。有研究發現，噬菌體可顯著減少96孔板（32%～69%）和不銹鋼表面（52%～98%）的沙門氏菌生物被膜，此外，他們通過人工感染家禽飲水器，來模擬自然界中沙門氏菌生物被膜的形成環境，發現噬菌體不僅顯著減少飲水器表面的沙門氏菌數量，還通過飲水來治療家禽沙門氏菌體內感染[45]。Gong 等[46]在研究噬菌體清除工人靴子上的沙門氏菌污染時，通過對比研究實驗室條件和工作環境中沙門氏菌生物被膜的清除效果，發現在實驗室條件下，經噬菌體處理，橡膠鞋底模板和靴子上沙門氏菌生物被膜分別減少了95.100%～99.999% 和91.5%～99.2%；在工作環境中，經噬菌體、噬菌體+次氯酸鈉和噬菌體+擦洗等3 種處理后，工人靴子上的沙門氏菌數量分別減少了84.2%、92.9%和93.2%。兩次結果均表明噬菌體可有效減少工人靴子上的沙門氏菌污染。

2.3.2 噬菌體裂解細菌生物被膜在細菌性疾病治療中的應用

Song 等[47]在噬菌體清除金黃葡萄球菌生物被膜的研究中表明，噬菌體不僅可清除金黃葡萄球菌生物被膜，還會在侵染細菌的過程中成倍增加，使其裂解生物被膜、殺滅細菌的能力大大增強。醫院常見糞腸球菌感染，常附著于各種醫療設備，傳播范圍廣，研究人員利用噬菌體清除耐萬古霉素糞腸球菌生物被膜，發現生物被膜生成量減少了2/3，提示噬菌體可有效去除耐萬古霉素糞腸球菌生物被膜[48]。Kunz 等[49]嘗試將噬菌體與抗生素聯用清除多重耐藥糞腸球菌生物被膜，分別利用氨芐青霉素、達托霉素、氨芐青霉素+達托霉素、單噬菌體、噬菌體混合物、噬菌體+抗生素組合的方法分析達托霉素耐藥菌株生物被膜的清除效果。結果表明，最佳清除方案為達托霉素+氨芐青霉素+噬菌體混合物，可完全清除生物被膜形態的糞腸球菌，且氨芐青霉素與任何噬菌體聯用均可呈現良好的生物被膜清除效果。Esmael等[50]研究發現，噬菌體混合物可減少鼠傷寒沙門氏菌和腸炎沙門氏菌生物被膜的形成。Webber等[51]研究發現，單一噬菌體或噬菌體雞尾酒均可減少沙門氏菌生物被膜的形成，噬菌體雞尾酒的能力更加顯著，清除率可達83.4%。

2.3.3 噬菌體裂解細菌生物被膜在食品行業中的應用

消除食品中沙門氏菌及其生物被膜的方法主要是使用殺菌劑、化學消毒劑、熱處理或其他特殊防腐劑，但這些方法不僅會影響食物的食用口感，甚至會造成化學試劑殘留，進而影響人類健康。

近年來，許多學者對噬菌體減少食品中沙門氏菌污染進行研究。在水、牛奶、雞胸肉、洋蔥等常見食品的研究中發現噬菌體可有效減少食品中沙門氏菌活菌數[52-53]。沙門氏菌常通過食品污染傳播，為應對沙門氏菌的食源性污染，研究者嘗試在飼料中添加噬菌體以期減少動物體內的沙門氏菌。Thanki 等[54]將噬菌體噴霧干燥制成粉末狀態與飼料混合，結果顯示，預防性地使用干噬菌體能夠減少沙門氏菌在仔豬胃、十二指腸、結腸和盲腸中的定植，且不會影響仔豬健康。Kimminau 等[55]研究表明，飼料中添加噬菌體也不會影響沙門氏菌活疫苗的功效。

傳統生物被膜清除方法存在耐藥問題、成本高、操作復雜、不適合畜牧業批量應用等缺點，在后抗生素時期，噬菌體作為一種清除沙門氏菌生物被膜的生物防治劑，效果良好，而且噬菌體感染周期短，增殖迅速，小劑量的噬菌體制劑即可清除宿主細菌[56]。噬菌體培養成本較低、適應性強、分布廣泛，發生腸炎沙門氏菌病傳播的地區往往能夠檢測到特異性噬菌體的存在[57-58]。目前針對噬菌體應用研究中實際應用的產品很少，且多用于治療細菌性疾病，因此利用噬菌體清除沙門氏菌生物被膜擁有巨大潛力。

3 結論

沙門氏菌廣泛存在于自然界中，患病動物排泄物增加了沙門氏菌環境污染程度，環境中沙門氏菌常以生物被膜的形式存在，相較于浮游態，生物被膜形態沙門氏菌更難清除。噬菌體作為新型減抗替抗產品，其自身編碼的解聚酶和溶素不僅可以特異性地裂解宿主菌，還能夠破壞EPS結構，裂解生物被膜。同時，由于噬菌體具有培養成本較低、適應性強、分布廣泛的特點，可以在清除環境中沙門氏菌生物被膜中發揮良好的效果，利用噬菌體清除沙門氏菌生物被膜擁有巨大潛力。