免疫膠體金技術及其在獸醫臨床中的應用研究進展

王中海

（ 甘肅省和政縣農業農村局，甘肅 臨夏 731200 ）

免疫膠體金技術是一種以膠體金為示蹤標志物，應用于抗原抗體的新型免疫標記技術[1]，可對血清及尿液進行檢測，且檢測時間很短，通常只需5～10 min即可完成檢測。免疫膠體金技術作為臨床中常見的一種標記技術，近年來逐漸發展成熟，并在多個領域得到了應用，獸醫臨床也開始廣泛使用免疫膠體金技術診斷多種疾病。目前，膠體金免疫層析技術和斑點金免疫滲濾法是免疫膠體金技術最常見的兩種應用類型。本文總結了免疫膠體金技術的應用類型，探究其應用優勢，闡述其在獸醫臨床中的應用進展，以期為免疫膠體金技術在獸醫臨床中更加廣泛的應用與研究提供參考。

1 免疫膠體金技術的應用類型

1.1 電鏡標記技術

1962年，有研究首次提出使用膠體金作為一種電鏡示蹤標志物，其具有的球形外觀和高電子密度能夠在圖像中得到較為清晰的顯示，可輕松地分辨膠體金和抗原。膠體金顆粒大小直徑在3～150 mm，根據使用者采取的制備方式，最終得到的膠體金顆粒大小也會有所不同[2]。電鏡標記技術具有靈敏度高、特異性強和定位精確等特點，還可對抗原進行定量、定性、定位的分析與觀察。應用ICG 雙重或多重標記法，可將形態、功能和結構的研究融為一體，有助于了解同一組織或細胞內不同分子的相互關系及其合成、分泌、轉運等代謝過程。通過膠體金免疫電鏡觀察，單個和個別堆集的病毒顆粒周圍有許多金顆粒附著，金顆粒出現強烈反差，因此，觀察時找到金顆粒聚集的地方即可找到病毒顆粒，表明該技術具有簡便、快速、靈敏直觀等特點，大大提高了檢測效果[3]。

1.2 膠體金免疫層析技術

膠體金免疫層析技術是近年來臨床中廣泛應用于診斷多種疾病的新技術，該技術同樣使用膠體金為示蹤物，其中最常用的是免疫膠體金層析試紙條（ICTSs）[4-6]。膠體金免疫層析技術作用原理是通過硝酸纖維素膜上毛細管的作用，樣品滴入后隨著硝酸纖維素膜上移，定位在纖維素膜上的受體與待測樣品結合，產生特異性反應；抗原和抗體的復合物不斷積累，膠體金的標志物通過沉淀顯示出顏色，以此實現檢測目的。膠體金免疫層析技術最初應用于檢測人絨毛膜促進性腺激素（HCG），隨著醫學技術進步，近年來該技術的應用范圍越來越廣。膠體金免疫層析技術具有快捷迅速、安全簡便、靈敏準確、成本低廉的優勢，但由于免疫層析是肉眼水平的免疫檢測，因此只能提供定性結果；其次，檢測的準確度受到抗體質量影響較大。

1.3 斑點金免疫滲濾法

斑點金免疫滲濾法又稱滴金免疫測定法，該方式將膠體金作為標志物，能夠在不對樣品的蛋白質生物活性造成影響的前提下開展測試，具備良好的穩定性。與免疫層析法相比，兩者具備相似的作用原理，但斑點金免疫滲濾法的過濾方式是液體過濾，過濾過程更順暢，檢測效率也更高。斑點金免疫滲濾法不受環境溫度影響，檢測時間短，省去了酶標底物反應過程，但滲濾裝置復雜、成本較高。

1.4 液相免疫測定

通過結合膠體金與抗體建立微量凝集試驗檢測相應的抗原，肉眼可直接觀察到凝集顆粒。利用免疫學反應時金顆粒凝聚導致顏色減退的原理建立的均相溶膠顆粒免疫測定法（sol particle immunoassay，SPIA）已成功應用于檢測PCG，直接應用分光光度計進行定量分析[7-9]。液相免疫測定不僅用于分離簡單化合物，還用于從細胞混合物中分離特定蛋白質。蛋白質與抗體結合，剩余的溶液通過柱子，然后使用另一種溶液釋放蛋白質并收集。這需要高度熟練的技術人員隨時監控色譜柱并確保該過程完全按計劃運行，才能保障檢驗的順利進行。

1.5 金標記流式細胞術

膠體金可明顯改變紅色激光的散射角。有研究利用膠體金標記的羊抗鼠Ig 抗體應用于流式細胞術分析不同類型細胞的表面抗原；結果顯示，膠體金標記的細胞在波長632 nm下，90度散射角可放大10倍以上，而且不影響細胞活性，與熒光素共同標記時彼此互不干擾[10]。流式細胞術的優點在于擁有強大的分選功能，能夠在分析的同時分選特定群體，還可對多種類樣品進行檢測，檢測速度快、樣本多。但其檢測的樣品必須為單細胞懸液，限制較大。

2 免疫膠體金技術的應用優勢

免疫膠體金技術的操作十分簡單，只需要通過專門的試劑盒或試劑條即可進行樣品的檢測，不要借助其他儀器及設備、試劑等，大大縮短了檢測的時間和流程。其次對于樣品的要求不高，通常只需在檢測前對樣品進行簡單處理，甚至不需要處理即可進行檢測。能夠應用于檢測的樣品也十分多樣，除了常見的血清外，還可使用組織液、糞便、尿液等進行檢測，極大地方便了樣品檢測，促進檢測流程的簡單化。常規檢測診斷技術需要經過復雜儀器的種種檢驗，且檢測過程需花費數小時，而免疫膠體金技術十分方便快捷，只需5～10 min 即可得到結果。與其相似的ELISA技術相比，同樣是選用試劑盒或試劑條的形式進行檢測，ELISA 診斷得到結果需要1～2 h，PCR 所需時間更長，由此可見，免疫膠體金技術的診斷效率更高[11]。同時免疫膠體金技術對于檢測環境的要求不高，能夠在日常生活環境中使用，受到場地限制較小。方便快捷的同時又能夠保障靈敏度。成本低也是免疫膠體金技術的另一項顯著優勢，一方面本身的試劑盒或試劑條較為實惠，另一方面是因為膠體金技術的檢測結果十分顯著，通常檢測者只需要通過肉眼觀察就能夠直觀地看到檢測結果，而不需要借助顯微鏡以及一些特殊設備，縮小檢測者的使用成本。免疫膠體金技術具有明顯的特異性，在不同的檢測條件下仍然能夠保障檢測結果的準確性。其次在檢測的過程中能夠同時對各個項目進行檢測，有利于提升樣品的使用率，減少檢測過程中的浪費。

3 免疫膠體金技術在獸醫臨床中的應用

3.1 免疫膠體金技術在病毒病診斷中的應用

免疫膠體金技術在獸醫臨床中得到廣泛應用，其中對于各種疾病的診斷具有良好效果。在對病毒病的診斷中，李華斌[12]選擇單抗3A4為金標抗體，單抗4F11作為檢測線抗體，羊抗鼠二抗為質檢抗體，制備了貓杯狀病毒（FCV）抗原檢測膠體金試紙條。組裝的試紙條對3種常見的貓病毒FCV及其他3種常見的貓病毒：貓細小病毒毒株（FPV）、貓皰疹病毒毒株（FHV）及貓傳染性腹膜炎病毒（FIPV）進行檢測,顯示特異性良好，無交叉反應；與RT-PCR 方法同時對94 份貓鼻咽拭子進行檢測，符合率在90%以上。楊曉童[13]分離了7 株新型鵝星狀病毒，制備了抗新型鵝星狀病毒的單克隆抗體和多克隆抗體，并建立了針對新型鵝星狀病毒的膠體金層析檢測方法。該方法最低檢出病毒量為1.2 mg/L，除新型鵝星狀病毒檢測結果為陽性外,常見禽源病原DAst V、GPV、H9-AIV、FAd V-4、DHAV-3 和TMUV 等檢測結果均呈陰性，無交叉反應；使用不同批次的試紙條均能夠檢出病毒，且與PCR 方法的符合率為92.5%。此外，在25 ℃室溫條件下該試紙條可穩定保存3 個月，4 ℃條件下可穩定保存5 個月，提示ICTSs 的穩定性較優。李書劍[14]制備的ICTSs能夠準確、簡便、快速地檢測C 型逆轉錄病毒禽網狀內皮組織增生癥病毒抗原，5～15 min 即可得到結果，不需要專業的設備和技術，適用于基層獸醫部門等不同單位對禽網狀內皮組織增生癥病毒的快速檢測，且成本低廉，經濟效益良好。2018年，非洲豬瘟首次在我國發生，隨后各地陸續出現疫情，對我國養豬業造成一定影響。該病的蔓延也對獸醫臨床診斷技術提出了新的要求，ICTSs 特異性、敏感性和穩定性良好，也成為臨床診斷非洲豬瘟的一種方法[15]。崔鶴馨等[16]在探究梅花鹿黏膜病病毒的快速檢驗方式中，嘗試研發免疫膠體金試紙條，最終結果顯示免疫膠體金技術的檢測效率高，對黏膜病病毒實現了有效鑒別，能夠達到快速檢測的效果。由此可見，免疫膠體金技術能夠為畜禽病毒性疾病提供有效的診斷技術，實現臨床的快速診斷。

3.2 免疫膠體金技術在細菌病診斷中的應用

有報道總結，免疫膠體金技術可臨床診斷布魯氏菌、牛分枝桿菌、霍亂弧菌、金黃色葡萄球菌、鴨疫里默桿菌、鰻弧菌、出血性大腸桿菌、豬霍亂沙門氏菌、副雞禽桿菌、空腸彎曲菌、炭疽桿菌、李斯特菌、土拉熱弗朗西斯菌、破傷風桿菌、鼻疽伯克霍爾德氏菌等多種細菌病[17]。韓文龍[18]研制了鴨疫里默氏桿菌OmpA單克隆抗體和免疫膠體金檢測試紙條，研制的試紙條可用于細菌培養物中鴨疫里默氏桿菌的檢測和鴨疫里默氏桿菌感染病鴨的臨床快速診斷，而且使用試紙條檢測感染鴨心臟組織樣品的檢出率高于組織樣品細菌分離鑒定的結果。王海麗等[19]在豬種布魯氏菌S2 株外膜蛋白OMP25 表達純化的基礎上，對金黃色葡萄球菌蛋白A進行膠體金標記，并噴涂于玻璃纖維上，制備了布魯氏菌抗體檢測膠體金免疫層析試紙條。該試紙條對羊布魯氏菌病陽性血清具有高度特異性，靈敏度與ELISA相當，在4 ℃條件下可保存9個月，室溫條件下可保存6 個月。楊松鑫等[20]基于Tris 輔助法制備均勻度好、穩定性強的膠體金，優化試紙條的最適pH 值、蛋白量和重懸比，建立的沙門氏菌膠體金免疫層析試紙條敏感性高、特異性好、重復性好，各方面性能均達到臨床快速檢測要求。陳詩勝[21]開發了檢測奶牛乳房炎主要致病菌的PCR核酸免疫層析試紙條，不需要進行核酸擴增后的凝膠電泳復雜操作環節，檢測方法更加安全、簡單、快速、便捷、廉價，可作為替代核酸凝膠電泳的新方法。

3.3 免疫膠體金技術在寄生蟲病診斷中的應用

寄生蟲病作為動物疫病的主要病癥之一，不僅會對動物的生活及生命安全造成影響，也可能會傳染人，因此必須注重對動物寄生蟲病的診斷，及時遏制傳染趨勢。寇金華等[22]制備1種檢測豬弓形蟲血清循環抗原的免疫膠體金試紙條，試驗利用檸檬酸三鈉還原法制備40 nm的膠體金溶液，標記抗弓形蟲表面抗原SAG3單克隆抗體（Anti-ASAG3-7），用另1 株抗弓形蟲表面抗原SAG3 單克隆抗體（Anti-A-SAG3-23）與羊抗小鼠IgG抗體分別包被檢測線和質控線，制備并優化免疫膠體金試紙條檢測條件。試紙條的靈敏度達1∶160，與豬囊蟲陽性血清無交叉反應，置于室溫至少可保存1個月有效，置于4 ℃可保存3個月有效。對廣東某地區、吉林某地區豬場的各94份豬待檢血清進行檢測,樣品陽性率為18.08%、10.63%。趙阿普[23]在對豬旋毛蟲病的診斷中同樣應用了免疫膠體金技術，研究結果顯示，與常規檢測方式相比，免疫膠體金的檢驗準確度高且成本低廉、易操作。邰利鑫[24]選用實驗室制備保存的微小隱孢子蟲病毒單克隆抗體作為捕獲抗體，制備兔抗微小隱孢子蟲病毒衣殼蛋白多克隆抗體作為檢測抗體，制作檢測牛糞便樣品中是否存在微小隱孢子蟲感染的膠體金試紙條，并與雙抗夾心ELISA、Dot-ELISA 檢測方法進行對比分析，為牛微小隱孢子蟲的動態監測提供參考。金程佳[25]將DLC2蛋白對檢測線進行劃線，以SPA 為標志物進行偶聯膠體金，質控線以1 mg/mL 雞抗SPA 二抗進行劃線，建立華支睪吸蟲病膠體金免疫層析法。該方法與日本血吸蟲、肝片吸蟲、日本棘隙吸蟲陽性血清均不發生交叉反應，特異性較好，可用于臨床樣本的快速診斷。試驗還采用該方法對臨床樣本進行了檢測，結果顯示寵物醫院樣本中陽性率為2.1%，流浪犬陽性率為5.6%，也為當地犬華支睪吸蟲感染情況提供了數據資料。

3.4 免疫膠體金技術在獸醫其他領域中的應用

除了對疾病的檢測外，膠體金層析技術在食源性致病菌如大腸埃希氏菌O157、志賀氏菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、單增李斯特氏菌、副溶血性弧菌、阪崎腸桿菌等方面也有大量應用研究[26]，還可檢測乳中是否存在雌二醇[27]、環丙沙星等[28]的殘留。隨著飼料工業不斷發展，免疫膠體金技術也開始應用于飼料中霉菌毒素（如黃曲霉毒素B1、赭曲霉毒素A和玉米赤霉烯酮等）的檢測[29-32]。

4 結論

免疫膠體金技術作為一項發展成熟的檢疫技術，具有操作簡單、方便快捷、成本低、特異性強等多種優勢，因此在各個領域中得到了廣泛應用。將免疫膠體金技術應用于獸醫臨床及畜牧生產中能夠實現對病原的快速診斷及目標物質的快速檢出，從而推動我國畜牧養殖業的發展。