LncRNA LUCAT1靶向調控miR-937-5p/MMP13軸對非小細胞肺癌細胞增殖、遷移能力的影響

付堂清 李文忠 羅仕云 師路 杜鎮鴻

肺癌是導致癌癥相關死亡的主要原因之一,非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)占所有肺癌病例的80%以上[1]。約60%的肺癌患者在確診時已處于晚期,無法通過根治性手術治療。由于NSCLC細胞對于化療、放療和靶向治療的耐藥性,晚期NSCLC的治療仍然極具挑戰[2,3]。長鏈非編碼核糖核酸(long non-coding ribonucleic acid,LncRNA)肺癌相關轉錄物1(lung cancer-associated transcript 1,LUCAT1)可以促進部分癌癥的進展。LUCAT1在NSCLC組織和細胞系中的表達水平顯著升高,促進NSCLC細胞對順鉑的耐藥性,敲低LUCAT1可顯著抑制了裸鼠異種移植腫瘤的生長[4,5]。這些研究證實LUCAT1是NSCLC的一個有潛力的治療靶點,而LUCAT1對NSCLC進程的促進作用的詳細機制值得進一步研究。微小RNA(microRNA,miRNA)在癌癥生物學中也占有重要地位,其中微小RNA-937-5p(microRNA-937-5p,miR-937-5p)是近期新發現的一類miRNA。據報道,miR-937-5p在結直腸癌中表達升高,可通過下調其靶基因促進腫瘤細胞增殖、遷移和血管生成[6]。據報道,基質金屬蛋白酶家族成員基質金屬蛋白酶13(matrix metalloproteinase 13,MMP-13)在包含NSCLC在內的腫瘤發展中具有重要作用[7]。因此,本研究將探究LUCAT1在NSCLC中的生物學功能及其調控機制,以期為NSCLC的靶向治療提供實驗依據,報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究經醫院倫理委員會批準,并且獲得每位患者的書面知情同意書,均按照赫爾辛基宣言的原則進行。招募2018年4月至2020年4月本院術前未接受放療、化療或靶向治療的65例NSCLC患者,其中男38例,女27例;平均年齡(52.45±6.36)歲,其中肺腺癌40例,患者診斷為患者肺鱗狀細胞癌25例。術中采集NSCLC組織及其相應癌旁組織,所有組織標本切除后立即在液氮中冷凍并保存在-80℃冰箱中待測。

1.2 主要材料 NSCLC細胞系H1299(YS743C)、H1975(YS213C)、A549(YS1995C)和H2228(YS3251C)與人正常肺上皮細胞系BEAS-2B(AC-2620H)均獲自美國典型培養物保藏中心(ATCC);胎牛血清(C0227)、青霉素-鏈霉素(ST488)、BrdU(≥99%,ST1056)、DAPI(C1002)、RIPA裂解液(P0013B)、ECL試劑盒(P0018FS)均獲自上海Beyotime;PRMI-1640培養基(A1049101)獲自美國Thermo Fisher Scientific;靶向LUCAT1的shRNA(sh-LUCAT1)和相應陰性對照(sh-NC)、miR-937-5p抑制物(anti-miR-937-5p)、miR-937-5p模擬物(miR-937-5p mimics)和相應陰性對照(miR-NC mimics)均購自上海Genepharma;Lipofectamine 2000(11668500)、pcDNA3.1表達載體(V79020)、TRIzol試劑(10296010)、SuperScript IV逆轉錄酶(18090010)購自美國Invitrogen;QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒(DXT-204143)獲自美國Aiagen;一抗MMP13(ab51072,60 kDa)、GAPDH(ab9485,37 kDa)、二抗山羊抗兔IgG H&L(HRP,ab205718)均獲自英國Abcam;Cell Counting Kit-8(CCK-8,CK04)獲自日本Dojindo;Dual-Luciferase Reporter Assay System(E1910)獲自美國Promega。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與轉染:人正常肺上皮細胞系BEAS-2B和NSCLC細胞系(H1299、H1975、A549和H2228)維持在含有10%胎牛血清、1%雙抗的PRMI-1640培養基中,在5%CO2的恒溫(37℃)培養箱中培養。將靶向MMP-13 mRNA序列亞克隆到pcDNA3.1獲得MMP-13過表達質粒(OE-MMP-13)。同時,將A549細胞轉移至96孔板中(1×104個/孔)依次分為Control組(正常培養)、sh-NC組(轉染sh-NC)、sh-LUCAT1組(轉染sh-LUCAT1)、sh-LUCAT1+anti-miR-937-5p組(轉染sh-LUCAT1和anti-miR-937-5p)、sh-LUCAT1+OE-MMP-13組(轉染sh-LUCAT1和OE-MMP-13)。轉染前,使用不含血清的PRMI-1640培養基培養24 h。按照說明,將Lipofectamine 2000與上述寡核苷酸或質粒混合,并添加到培養基中,24 h后更換為完全培養基,繼續培養24 h,用定量實時聚合酶鏈反應(quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)和蛋白印跡檢測轉染效率。

1.3.2 qRT-PCR檢測基因相對表達水平:使用TRIzol試劑從組織或細胞中提取總RNA。采用微量分光光度計(美國NanoDrop 2000)檢測總RNA的濃度和純度,采用Agilent-2100凝膠電泳系統(上海安捷倫)檢測總RNA的完整性。使用逆轉錄試劑盒進行RNA的逆轉錄。使用QuantiTect SYBR Green PCR試劑盒在ABI 7500 FAST實時PCR系統(美國Applied Biosystems)上進行qRT-PCR。GAPDH用作LUCAT1和MMP13 mRNA定量的內部對照,U6用作miR-937-5p定量的內部對照。根據2-ΔΔCt公式計算目的基因相對表達水平,引物由中國深圳華大基因公司合成。本研究中使用的詳細引物序列如下:LUCAT1:正向5’-ACCAGCTGTCCCTCAGTGTTCT-3’,反向5’-AGGCCTTTATCCTCGGGTTGCCT-3’;miR-937-5p正向5’-GTGAGTCAGGGTGGGGCTGG-3’,反向5’-TGGTGTCGTGGAGTCG-3’;MMP13正向5’-CCTGGACAAGTAGTTCCAAAGG-3’,反向5’-AGGGATAAGGAAGGGTCACAT-3’;GAPDH正向5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’,反向5’-GAAGATTGGTGATGGGATTTC-3’;U6正向5-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’,反向5-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。

1.3.3 蛋白印跡檢測蛋白水平:將轉染后的A549細胞用RIPA裂解液提取總蛋白。將蛋白與上樣緩沖液混合后變性。隨后,將每組中蛋白質樣品通過SDS-PAGE分離后轉移至PVDF膜,5%脫脂牛奶封閉膜1 h。添加一抗(MMP-13和GAPDH,稀釋度1∶1 000),將PVDF膜在4℃下孵育過夜。使用二抗(山羊抗兔IgG,稀釋度1∶5 000)孵育1.5 h。ECL試劑盒對蛋白質顯影后使用Image J對蛋白質條帶的灰度值進行定量分析。GAPDH作為內部對照。

1.3.4 CCK-8檢測細胞活力:將轉染后的A549細胞制備單細胞懸液并轉移至96孔板中(2×103個/孔),培養48 h后向每個孔中添加10 L CCK-8溶液,1 h后使用SAFAS Xenius XL酶標儀(上海瑞軒)檢測每個孔在450 nm處的吸光度。

1.3.5 BrdU檢測細胞增殖:將轉染后的A549細胞制備單細胞懸液并接種到24孔板中(1×105個/孔),向每孔中添加BrdU試劑,培養12 h后,將細胞與抗BrdU抗體在室溫下孵育2 h。之后使用DAPI染色液對細胞進行復染。然后在CX41熒光顯微鏡(日本Olympus)下對BrdU陽性細胞數和DAPI陽性細胞數進行統計。細胞增殖率(%)=BrdU陽性細胞/DAPI陽性細胞×100%。

1.3.6 Transwell檢測細胞遷移:無血清培養基將轉染后的A549細胞制備單細胞懸液,細胞密度為1×105個/ml。吸取100 μl懸浮液加入到Transwell小室的上室中,下室中加入600 μl含有10%胎牛血清的PRMI-1640培養基。24 h后,用棉簽擦去上室剩余的細胞,遷移的細胞用4%多聚甲醛固定,結晶紫染色。在顯微鏡下對通過膜的細胞進行計數。

1.3.7 雙熒光素酶報告基因檢測:將預測的LUCAT1或MMP13 3’-UTR與miR-937-5p之間的結合序列擴增并克隆到pmirGLO載體中用于構建野生型(WT)報告載體(LUCAT1 WT和MMP-13 WT)。然后對結合序列進行突變,將突變的序列擴增并克隆到pmirGLO載體中用于構建突變型(MUT)報告載體(LUCAT1 MUT和MMP-13 MUT)。將上述報告載體與miR-937-5p mimics或miR-NC mimics共轉染到A549細胞中。48 h后測定熒光素酶的活性,螢火蟲熒光素酶的活性標準化為海腎熒光素酶的活性。

1.3.8 體內實驗:體內實驗經本醫院倫理委員會審查并批準。20只雄性BALB/c裸鼠,6～8周齡,平均體重(22.5±2.0) g,購自河南省實驗動物中心,許可證號SCXK(豫)2017-0001。將裸鼠維持在標準動物房條件下(23℃、40%濕度、12 h光照和黑暗循環、自由獲取食物和水)。適應飼養后將動物分為2組(sh-NC組和sh-LUCAT1組,每組10只)。將上述轉染的A549細胞(1×105個/只)注射到對應裸鼠中,3周后,將裸鼠安樂死,測量腫瘤體積并稱重。通過qRT-PCR檢測各腫瘤組織中LUCAT1、miR-937-5p和MMP13 mRNA相對表達水平。

2 結果

2.1 LUCAT1、miR-937-5p和MMP-13 mRNA在NSCLC組織和細胞系中的表達水平 與癌旁組織比較,NSCLC組織中LUCAT1和MMP-13 mRNA表達水平明顯增高,miR-937-5p表達明顯降低(P<0.05)。與BEAS-2B細胞相比,NSCLC細胞系中LUCAT1和MMP-13 mRNA表達水平明顯增高,miR-937-5p表達明顯降低,差異均有統計學意義(P<0.05)。鑒于在NSCLC細胞系中,A549細胞中LUCAT1表達最高,因此選用此細胞建立LUCAT1敲低細胞模型,進行后續研究。見表1、2。

表1 qRT-PCR檢測組織中LUCAT1、miR-937-5p和MMP-13 mRNA表達

表2 qRT-PCR檢測細胞中LUCAT1、miR-937-5p和MMP-13 mRNA表達

2.2 5組A549細胞轉染效率驗證 與sh-NC組比較,sh-LUCAT1組A549細胞中LUCAT1和MMP-13表達水平均顯著降低,miR-937-5p表達顯著增高,差異均有統計學意義(P<0.05)。與sh-LUCAT1組比較,sh-LUCAT1+anti-miR-937-5p組A549細胞中LUCAT1表達變化未達到統計闕值(P>0.05),miR-937-5p表達顯著降低,MMP-13表達顯著增高,差異均有統計學意義(P<0.05);sh-LUCAT1+OE-MMP-13組A549細胞中LUCAT1和miR-937-5p表達變化未達到統計闕值(P>0.05),MMP-13表達顯著增高(P<0.05)。而sh-NC組與Control組相比,以上各基因表達差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3,圖1。

表3 5組A549細胞中LUCAT1、miR-937-5p和MMP-13表達情況

圖1 免疫印跡檢測A549細胞中MMP-13蛋白水平;1～5依次表示為Control組、sh-NC組、sh-LUCAT1組、sh-LUCAT1+anti-miR-937-5p組和sh-LUCAT1+OE-MMP-13組

2.3 5組A549細胞增殖、遷移能力 與sh-NC組比較,sh-LUCAT1組A549細胞活力、細胞增殖率和遷移細胞數量均顯著降低(P<0.05)。與sh-LUCAT1組比較,sh-LUCAT1+anti-miR-937-5p組或sh-LUCAT1+OE-MMP-13組A549細胞活力、細胞增殖率和遷移細胞數量均顯著增高(P<0.05)。而sh-NC組與Control組比較,以上指標差異均無統計學意義(P>0.05)。見圖2、3,表4。

圖2 BrdU檢測5組A549細胞增殖情況(×200)

圖3 Transwell檢測5組A549細胞遷移情況(×200)

表4 5組A549細胞增殖、遷移情況比較

2.4 LUCAT1、miR-937-5p和MMP-13之間關系驗證 使用生物信息學工具分析發現,LUCAT1與miR-937-5p、miR-937-5p與MMP-13 3’UTR之間存在相互作用位點。通過雙熒光素酶報告基因檢測證實,轉染miR-937-5p mimics顯著抑制了LUCAT1 WT報告載體的熒光素酶活性(P<0.05),而LUCAT1 MUT的熒光素酶活性未觀察到明顯變化(P>0.05),說明LUCAT1與miR-937-5p之間存在相互作用關系。同理證實miR-937-5p與MMP-13之間亦存在相互作用關系。見圖4,表5。

圖4 生物信息學預測LUCAT1與miR-937-5p、miR-937-5p與MMP-13 3’UTR之間存在互補結合位點

表5 雙熒光素酶驗證LUCAT1與miR-937-5p、miR-937-5p與MMP-13 3’UTR相互作用關系

2.5 敲低LUCAT1調控miR-937-5p/MMP-13軸抑制NSCLC細胞體內生長 用異種移植腫瘤檢查LUCAT1對NSCLC細胞體內生長的影響。與sh-NC組比較,sh-LUCAT1組裸鼠腫瘤體積及重量均顯著降低(P<0.05)。qRT-PCR結果顯示,敲低LUCAT1后,腫瘤組織中miR-937-5p水平升高,MMP-13 mRNA水平降低(P<0.05)。見圖5,表6。

圖5 2組裸鼠解剖的腫瘤圖像

表6 敲低LUCAT1通過調控miR-937-5p/MMP-13軸抑制NSCLC細胞體內生長

3 討論

肺癌的發病率和死亡率都很高,NSCLC作為常見的肺癌類型,引起了極大的關注。鑒于目前晚期NSCLC患者預后較差,存活率低[8]。因此,深入了解NSCLC的分子機制對制定有效的治療策略具有極大幫助。越來越多的研究證實LncRNA在包含NSCLC在內的多種癌癥的發生和進展中發揮重要作用。例如:PCGEM1在NSCLC細胞和組織中上調,敲低其表達可顯著抑制NSCLC細胞惡性行為進展[9]。在以往的研究中,LUCAT1在NSCLC中的作用已經得到初步的探索。據報道,LUCAT1在NSCLC組織和細胞系中表達水平升高,并且LUCAT1的敲低阻礙了NSCLC細胞的增殖、遷移和侵襲;此外,LUCAT1的敲低會增加A549細胞對順鉑的敏感性[4]。

本研究表明LUCAT1的表達在NSCLC組織和細胞系中顯著增加。通過體外功能實驗表明,敲低LUCAT1抑制了NSCLC細胞活力、增殖和遷移。此外,NSCLC體內異種移植腫瘤實驗表明,LUCAT1的敲低抑制了體內腫瘤組織的生長。以上結果表明,LUCAT1是NSCLC中的一種致癌LncRNA,可能是該病有希望的治療靶點。

競爭性內源性RNA(ceRNA)網絡是一種常見的轉錄后調控機制,是指LncRNA與mRNA競爭與miRNA結合,從而解除miRNA對mRNA的抑制作用[10]。這種由LncRNA和miRNA相互作用形成的ceRNA網絡已經在包括NSCLC在內的多種癌癥的發展中被報道[11]。例如,EWSAT1通過競爭性結合miR-330-5p調節其表達進而影響NSCLC進展[12]。因此,本研究探討了LUCAT1是否作為ceRNA上調NSCLC中某些mRNA。通過生物信息學分析發現,miR-937-5p可能是LUCAT1的潛在靶標。在之前的一些研究中探索了miR-937-5p在癌癥生物學中的作用。例如:miR-937-5p在乳腺癌中發揮原癌基因作用,抑制其表達可顯著抑制乳腺癌細胞增殖并引起S期細胞停滯[13]。在這項研究中發現,miR-937-5p在NSCLC組織和細胞中表達降低,與前人研究[6,13]并不相同。表明miR-937-5p在NSCLC中發揮抑癌作用,其在不同癌癥中可能發揮不同的生物學效應。隨后,通過雙熒光素酶報告基因實驗檢測并證實了miR-937-5p與LUCAT1之間的相互作用,同時抑制LUCAT1可明顯上調miR-937-5p的表達,表明LUCAT1可靶向負調控miR-937-5p表達。此外,轉染miR-937-5p抑制劑逆轉了敲低LUCAT1對NSCLC細胞增殖和遷移的影響。這些數據表明LUCAT1通過與miR-937-5p結合參與NSCLC的發展功能。

MMP-13是首次在乳腺癌中發現的一類發揮致癌作用的基因,下調其表達可顯著抑制癌細胞進展[14]。例如抑制MMP-13表達可通過抑制前列腺癌細胞的侵襲和遷移能力阻止前列腺癌的轉移[15]。已有研究證實,MMP-13過表達可作為肺腺癌患者發生腦轉移的驅動因素之一[16],且上調MMP-13表達可增加肺腺癌的順鉑耐藥[17]。另外,MMP-13還可作為遷移、侵襲標志性蛋白促進肺癌轉移性[3,18]。在本研究中,MMP-13被證實是miR-937-5p的新靶點,同時證明LUCAT1可通過靶向miR-937-5p間接調控MMP-13的表達。同時證實,過表達MMP-13可明顯抑制敲低LUCAT1對NSCLC增殖、遷移的影響。以上數據表明,由LUCAT1、miR-937-5p和MMP-13形成的ceRNA網絡導致NSCLC中MMP-13表達失調,進而影響NSCLC細胞增殖和遷移。

總之,以上研究表明敲低LUCAT1可以通過靶向上調miR-937-5p表達間接抑制MMP-13的表達,進而通過抑制細胞增殖和遷移在NSCLC中發揮抑癌作用。