瓜實蠅成蟲對不同殺蟲劑相對敏感基線的建立

陳 黔，楊 朗，黃立飛，曹雪梅，張建民，姜建軍

（1.長江大學農學院 湖北荊州 434025；2.農業農村部華南果蔬綠色防控重點實驗室 南寧 530007；3.廣西作物病蟲害生物學重點實驗室·廣西壯族自治區農業科學院植物保護研究所 南寧 530007）

瓜實蠅Zeugodacus cucurbitae（Coquillett）隸屬雙翅目實蠅科鏃果實蠅屬昆蟲，原產于印度，分布于亞洲、大洋洲、非洲和美洲的熱帶和亞熱帶地區，是一種果蔬上主要的入侵性害蟲[1-2]，在我國主要分布于廣西、廣東、海南、四川、福建、臺灣和香港等省份和地區。瓜實蠅為多食性，危害的寄主主要包括黃瓜、南瓜、甜瓜、西葫蘆、絲瓜、西瓜、苦瓜等20 余科120 多種果蔬[3-5]，雌成蟲產卵于瓜果表皮組織內，偶產卵于花蔓，孵化后的幼蟲鉆蛀至果實內部取食，造成受害果實腐爛、畸形和落果，影響作物產量和品質，危害嚴重時果實受害率在30%～100%，給生產造成嚴重損失[6-8]。目前生產上已有多種防控該蟲的方法，如生物防治、信息素引誘、黃板誘殺、果實套袋、種植抗蟲品種、化學防治和雄性不育治理技術等[9-11]，但采用化學殺蟲劑仍是防治瓜實蠅最普遍和常用的手段。

化學殺蟲劑的頻繁使用，易使害蟲產生抗藥性，導致常規劑量藥效下降，從而增加農藥用量，縮短農藥使用壽命，間接給經濟、環境和人類食品安全帶來風險[12]。熱帶和亞熱帶地區（如我國海南、廣西等地）適宜的氣候可周年種植瓜類蔬菜，瓜實蠅在這些擁有充足寄主植物和適宜氣候條件的地區無越冬現象并終年可見[13-15]，而這意味著需全年對瓜實蠅進行防治。前人研究表明，田間瓜實蠅已對微生物源農藥（阿維菌素、多殺菌素）和有機磷類殺蟲劑農藥（倍硫磷、敵百蟲）等產生了不同程度的抗藥性[16-18]。監測了解害蟲田間種群對不同殺蟲劑的抗藥效性發展水平，從而指導合理用藥是延緩和治理其抗藥性的有效方法之一[19]。張帥等[20]于2013－2015 年連續對華北地區棉花主要害蟲進行抗藥性監測，在明確主要害蟲棉鈴蟲、綠盲蝽和棉蚜對殺蟲劑抗藥性水平的基礎上，實施以輪換用藥為主的抗性治理示范，每667 m2減少3 次用藥后增加棉花產量7.53%，節本增收109.16 元。張小磊等[21]于2009－2014 年研究表明，湖北稻區褐飛虱田間種群對噻蟲嗪、噻嗪酮抗性上升明顯，對吡蟲啉抗性也有上升的趨勢，因此建議田間暫停吡蟲啉、噻嗪酮在水稻上防治褐飛虱，嚴格限制吡蚜酮在水稻上的使用次數，醚菊酯可作為吡蟲啉、噻嗪酮和吡蚜酮的替代藥劑或輪換藥劑。為了掌握主要農作物病蟲害抗藥性狀況，從而針對具體抗性情況提出治理對策，我國農技推廣服務中心從2008 至今連續多年牽頭監測與發布水稻、棉花、玉米和蔬菜等重要農業有害生物抗藥性監測報告與治理對策[22-24]。害蟲抗藥性主要是隨著殺蟲劑的連續使用而逐漸產生。因此，害蟲對某種藥劑有無抗藥性，只是相對的比較[25]，所以在對害蟲進行抗藥性監測前，必須建立可靠的敏感毒力基線，只有具備了敏感基線，才能確定區分劑量和準確地判斷田間害蟲種群是否已經產生抗藥性及抗藥性的程度和范圍[26]。敏感基線（sensitivity baseline）是通過生物測定方法得到的害蟲敏感品系（或種群）對殺蟲劑的劑量反應曲線[27]，其測定方法是用一系列藥劑劑量或濃度處理供試生物，以劑量對數值和相應死亡率概率值繪圖，求其直線回歸方程、斜率（b值）及LD50等毒力分析數據。研究和評估害蟲抗藥性的發展水平，采用的測定方式不同則表示方法不同，如一般點滴法采用半數致死量（LD50）來表示比較，藥膜法、飼毒法和浸葉法等采用致死中濃度（LC50）來表示，還有半數擊倒量（KD50）和半數擊倒時間（KT50）等表示方法，但所有的表示方式其抗性水平求法基本相同[28]。

由于瓜實蠅幼蟲在瓜果內蛀食為害，藥劑難于接觸，所以田間藥劑主要針對其成蟲進行防治，目前國內外有關瓜實蠅成蟲對殺蟲劑敏感基線的研究已有部分報道。Hsu 等[17]以室內飼養超過300 代的試蟲為敏感品系，分別采用點滴法和飼毒法建立了瓜實蠅成蟲對多殺霉素的敏感基線。谷世偉等[18]以室內飼養24 代的試蟲為敏感品系，采用藥膜法建立了瓜實蠅對敵百蟲、氯氟氰菊酯、高效氯氰菊酯、甲維鹽、阿維菌素、多殺霉素的敏感基線。隨著田間用藥種類的增加，為了補充更多數據以用于田間瓜實蠅抗藥性監測，筆者的研究以室內標準化連續飼養63 代的瓜實蠅為相對敏感品系，采用點滴法和飼毒法測定了田間常見的17 類30 種殺蟲劑對瓜實蠅成蟲的毒力及建立相對敏感基線，并比較分析了2 種方法對阿維菌素抗性品系的抗性水平測定結果的差異，以期為瓜實蠅的田間抗藥性監測和抗藥性綜合治理提供參考。

1 材料和方法

1.1 材料

供試昆蟲：瓜實蠅敏感品系（susceptible strain，SS）是2012 年采自廣西南寧郊區苦瓜上，在室內標準化連續飼養至2022 年已63 代的種群。飼養條件為溫度（26±1）℃，濕度（75±5）%，光周期L/D=14 h/10 h。用削皮后的南瓜（市售）接卵和飼養幼蟲，成蟲采用酵母與蔗糖混合物飼養（w酵母∶w糖=1∶3）。瓜實蠅抗阿維菌素品系（resistant strain，RS），以上述采自野外的種群室內經飼毒法選育至33 代后獲得。

供試藥劑：筆者研究所用藥劑及來源見表1，其他試劑為丙酮分析純（成都市科隆化學品有限公司），吐溫-80[生工生物工程（上海）股份有限公司]。

表1 試驗所用藥劑

1.2 生物測定

1.2.1 點滴法毒力測定 參考農業部發布的方法[29]和Hsu 等[17]所述方法進行。具體步驟如下：首先用丙酮把原藥溶解配制成母液，然后在預試驗的基礎上將母液用丙酮等比稀釋成5～6 個系列工作濃度。取羽化4～5 d 的瓜實蠅成蟲（雌蟲∶雄蟲=1∶1），CO2氣體迷暈后，用鑷子夾住其翅膀，采用微量點滴儀（Burkard，英格蘭）把1 μL 藥劑點滴于前胸背板，點滴后的試蟲放置于自制的養蟲杯中，杯中放入水和飼料，飼養條件同1.1 中所述。每處理4個重復，每重復20 頭蟲，以點滴等量丙酮的瓜實蠅成蟲為空白對照處理。

1.2.2 飼毒法毒力測定 參考Hsu[30]和Kakani 等[31]的方法略有改動。具體操作如下：用丙酮把原藥溶解配制成母液，然后在預試驗的基礎上將母液用含0.5%吐溫-80 和10%蜂蜜的水溶液等比稀釋成5～7個系列工作濃度。在自制的養蟲杯底部放置1 個15 mm×15 mm 規格的稱量杯，稱量杯中放置脫脂棉球。然后在棉球中加入2 mL 不同濃度的藥液使其完全濕潤。杯中放入羽化4～5 d 已饑餓24 h 的瓜實蠅成蟲20 頭（雌蟲∶雄蟲=1∶1），取食藥劑處理24 h 后，取出藥劑，換用正常的水和食物飼養，飼養條件同前述。每處理4 次重復，每個重復20 頭蟲。以不含藥劑的上述稀釋藥劑用溶液作為空白對照處理。

上述2 種方法生物測定中，滅蠅胺、氟啶蟲酰胺、苯氧威和氟啶脲96 h 后統計處理死亡蟲數[32]，其他藥劑處理后48 h 統計死亡蟲數。處理后的試蟲以不能移動或用毛筆反轉后5 s 內不能翻身判斷為死亡。2 種方法敏感基線測定所用試蟲均為敏感品系63 代種群，在連續的時間內完成測定。

1.3 抗阿維菌素品系抗藥性水平測定

采用點滴法和飼毒法分別測定阿維菌素對RS品系的毒力，比較分析2 種方法測定的抗性品系對阿維菌素的抗藥性水平是否存在較大差異。測定方法同1.2，每處理均設4 個重復，每重復20 頭蟲。抗藥性水平計算方法：抗藥性品系致死中濃度（lethal concentration of 50%，LC50）/敏感品系致死中濃度（LC50）（飼毒法）或抗藥性品系致死中量（lethal dose of 50%，LD50）/敏感品系致死中量（LD50）（點滴法）。

1.4 數據分析

根據劑量對數和死亡概率值直線回歸法，采用SPSS 19 軟件進行統計分析，為了消除蟲體本身或環境因素引起的試蟲死亡率太高，導致試驗數據偏差，設置所有處理空白對照組死亡率小于10%為有效數據[32]，統計計算LD50或LC50值及其95%置信區間、毒力回歸線斜率值及其標準誤（SE）、卡方值（χ2）、自由度（df）及P值。

2 結果與分析

2.1 點滴法測定瓜實蠅對殺蟲劑的相對敏感基線

由表2 可以看出，點滴法結果表明，瓜實蠅成蟲對微生物源類的甲維鹽、阿維菌素和多殺霉素最敏感，LD50值在3.422～5.117 ng·頭-1；3 個菊酯類LD50值在39.902～56.698 ng·頭-1；有機磷類樂果和辛硫磷農藥LD50值為20.929、41.692 ng·頭-1；吡唑類唑蟲酰胺、1 個有機磷類農藥馬拉硫磷及吡咯類蟲螨腈的LD50值在104.789～196.840 ng·頭-1；4 個煙堿類農藥LD50值較為接近，其值介于266.456～274.348 ng·頭-1之間；雙酰胺類溴氰蟲酰胺、氨基甲酸酯類仲丁威和植物源農藥魚藤酮LD50值在341.080～576.842 ng·頭-1。除了上述18 種農藥，其他包括煙堿類的烯啶蟲胺和吡蟲啉、植物源農藥D-檸檬烯和苦參堿、硫脲類的丁醚脲，季酮酸類螺蟲乙酯，噁二嗪類茚蟲威，三嗪類滅蠅胺，吡啶酰胺類氟啶蟲酰胺，非萜烯類苯氧威，苯甲酰脲類氟啶脲和吡啶類吡蚜酮等12 種農藥因瓜實蠅成蟲極為不敏感，無法測出其毒力。同時根據毒力LD50測定結果，瓜實蠅對不同殺蟲劑敏感性排序為甲維鹽＞多殺霉素＞阿維菌素＞樂果＞高效氯氰菊酯＞溴氰菊酯＞辛硫磷＞高效氯氟氰菊酯＞唑蟲酰胺＞馬拉硫磷＞蟲螨腈＞噻蟲嗪＞噻蟲胺＞啶蟲脒＞呋蟲胺＞溴氰蟲酰胺＞仲丁威＞魚藤酮。

表2 瓜實蠅對不同殺蟲劑敏感基線（點滴法）

2.2 飼毒法測定瓜實蠅對殺蟲劑的相對敏感基線

由表3 可以看出，飼毒法結果有21 種藥劑測出了LC50值。在這21 種藥劑中除魚藤酮LC50=60.542 mg·L-1外，其他藥劑LC50值均低于27.000 mg·L-1，其中甲維鹽、阿維菌素和多殺霉素3個生物源農藥LC50值在0.035～0.123 mg·L-1；3 個菊酯類藥劑LC50值較為接近，在1.090～1.695 mg·L-1；有機磷類樂果LC50=0.302 mg·L-1、辛硫磷和馬拉硫磷LC50分別為3.479 mg·L-1和4.710 mg·L-1。6 個煙堿類藥劑中，烯啶蟲胺LC50=26.507 mg·L-1、吡蟲啉LC50=13.972 mg·L-1，其余4 種藥劑LC50在1.399～6.350 mg·L-1；雙酰胺類溴氰蟲酰胺、吡咯類蟲螨腈、吡唑類唑蟲酰胺、氨基甲酸酯類仲丁威和噁二嗪類茚蟲威的LC50值分別為1.396、6.403、11.552、18.535、18.810 mg·L-1。其他包括植物源農藥D-檸檬烯和苦參堿，硫脲類的丁醚脲，季酮酸類螺蟲乙酯，三嗪類滅蠅胺，吡啶酰胺類氟啶蟲酰胺，非萜烯類苯氧威，苯甲酰脲類氟啶脲和吡啶類吡蚜酮等9 種農藥因瓜實蠅成蟲對其極為不敏感，無法測出其毒力。同時根據毒力LC50測定結果，瓜實蠅對不同殺蟲劑的敏感性由高到低排序為甲維鹽＞阿維菌素＞多殺霉素＞樂果＞溴氰菊酯＞高效氯氰菊酯＞溴氰蟲酰胺＞噻蟲胺＞高效氯氟氰菊酯＞噻蟲嗪＞呋蟲胺＞辛硫磷＞馬拉硫磷＞啶蟲脒＞蟲螨腈＞唑蟲酰胺＞吡蟲啉＞仲丁威＞茚蟲威＞烯啶蟲胺＞魚藤酮。

表3 瓜實蠅對不同殺蟲劑敏感基線（飼毒法）

2.3 抗阿維菌素品系抗藥性水平測定

采用點滴法和飼毒法測得的瓜實蠅抗阿維菌素品系抗性水平見表4，由表中結果可知點滴法測得的抗性水平為18.22 倍，飼毒法測得的抗性水平為17.37 倍，2 種方法測得的抗性水平結果相接近。

3 討論與結論

化學殺蟲劑防治田間害蟲時，需考慮藥劑作用于靶標對象的方式（觸殺、胃毒等）、靶標害蟲種群在田間對藥劑的耐受性、不同類型殺蟲劑對種群抗藥性水平的影響等[27]。目前生產上化學防治果實蠅類害蟲主要采用噴灑殺蟲劑和懸掛或定點投放毒餌等[16，33-34]，根據瓜實蠅成蟲生活習性特征，噴霧防治以觸殺為主兼顧胃毒，毒餌誘殺以胃毒為主兼顧觸殺。對害蟲的藥劑敏感性或抗性進行測定時，不同的生物測定方法會測得不同的毒力結果[19]。點滴法主要測定殺蟲劑的觸殺作用，定量精確。飼毒法主要測定殺蟲劑胃毒作用兼顧觸殺作用。因此2種方法雖均可測定出大部分藥劑對害蟲的毒力，在抗藥性監測和機制研究中廣泛應用，但也需要根據測定目的和藥劑的作用方式來選擇合適的方法[32]。

在筆者的研究中，點滴法試驗結果表明，瓜實蠅成蟲對吡蟲啉、茚蟲威、烯啶蟲胺不敏感，無法測出其毒力。而采用飼毒法，上述3 種藥劑表現出對瓜實蠅具有一定的毒力，說明這3 種藥劑對瓜實蠅具有胃毒作用，無觸殺活性。另外采用2 種方法測定的藥劑毒力排序也發生了一定變化，如溴氰蟲酰胺在點滴法中相對排序第16 位，LD50=341.080 ng·頭-1，而飼毒法中排序為第7 位，LC50=1.396 mg·L-1。辛硫磷和唑蟲酰胺點滴法中排序分別為第7 位和第9位，LD50值分別為41.692、104.789 ng·頭-1，飼毒法中兩種藥劑排序分別為第12 位和第16 位，說明相對于其他藥劑，溴氰蟲酰胺對瓜實蠅胃毒作用要優于觸殺，而辛硫磷和唑蟲酰胺觸殺作用優于其胃毒作用。因此，在生產上建議研發瓜實蠅藥劑時如溴氰蟲酰胺可優先以毒餌劑型為主，而辛硫磷和唑蟲酰胺則可開發以觸殺作用的劑型為主。同時，采用點滴法和飼毒法測定室內選育的阿維菌素抗藥性品系，結果顯示，2 種方法測得的抗性水平分別為18.22 倍、17.37 倍，較為接近，因此在應用中可以根據實際情況選擇適合的方法進行抗藥性監測，如點滴法要求需要精密的點滴儀，操作起來相對較繁瑣，而飼毒法對操作儀器無要求，操作簡便，可以優先選擇。

室內生測建立害蟲對不同殺蟲劑的敏感性基線，結合田間抗藥性水平監測，可以為害蟲田間化學防治藥劑選擇提供參考。根據筆者研究的點滴法和飼毒法測定的瓜實蠅對不同殺蟲劑的相對敏感基線結果，2 種方法中微生物源類農藥甲維鹽、阿維菌素和多殺霉素及有機磷類的樂果均表現出對瓜實蠅成蟲較高的毒力，其次是菊酯類、有機磷類和煙堿類，因此建議生產中可輪換使用上述幾類藥劑，但是上述幾種類型藥劑間是否存在交互抗藥性需要注意觀察和進一步研究。煙堿類的吡蟲啉和烯啶蟲胺，采用點滴觸殺時并未表現出毒力，雖然飼毒法對瓜實蠅有一定毒性，但相對其他4 個煙堿類殺蟲劑其LC50值較高，因此建議田間選擇煙堿類殺蟲劑應避免選擇這2 種藥劑。植物源農藥D-檸檬烯和苦參堿、硫脲類的丁醚脲、季酮酸類螺蟲乙酯、三嗪類滅蠅胺、吡啶酰胺類氟啶蟲酰胺、非萜烯類苯氧威、苯甲酰脲類氟啶脲和吡啶類吡蚜酮9 種殺蟲劑采用2 種方法無法測出其對瓜實蠅成蟲的毒力，同時噁二嗪類茚蟲威采用點滴法也不能測出其致死中量，表明瓜實蠅成蟲對上述10 種藥劑較為不敏感，生產中也應避免用于防治瓜實蠅成蟲。

毒力敏感基線的建立是抗藥性水平監測的重要依據和基礎工作，而敏感品系的獲得是建立敏感基線的基礎。筆者的研究所用敏感品系為在室內飼養近10 年至今已63 代的蟲源，相比于田間種群其對各種農藥的相對敏感性較高和穩定，如Hsu等[17]采用點滴法對室內飼養超過300 代的敏感品系瓜實蠅成蟲測定其對多殺霉素的毒力敏感性，結果顯示，LD50值為3.16 ng·頭-1，筆者所用瓜實蠅敏感品系測得的LD50值為5.117 ng·頭-1，推測造成差異的原因是筆者研究用種群在室內飼養代數為63 代可能還未達到完全敏感，但2 個種群對多殺霉素的LD50差異不是太大，顯示筆者研究所用的瓜實蠅已經相對敏感，建立的相對敏感基線可以為瓜實蠅抗藥性監測相關研究提供參考依據。下一步筆者計劃以此研究建立的敏感基線為基礎，對我國不同地區田間瓜實蠅種群抗藥性進行調查和監測，以期為該蟲綜合防控提供數據支撐。

瓜實蠅作為果蔬上的一種主要害蟲，長期以來的田間用藥情況和抗藥性水平數據缺乏，因此筆者采用點滴法和飼毒法分別建立了瓜實蠅成蟲對18種和21 種殺蟲劑的相對敏感基線，對今后長期系統監測其抗藥性發展，指導合理用藥，避免農藥的濫用和抗性綜合治理具有重要的參考價值。